靶向定量120种肠道菌群代谢物的GC-MS/MS方法开发及其在微生物-宿主互作研究中的应用

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Development of a GC-MS/MS method to quantify 120 gut microbiota-derived metabolites

本文开发了一种基于GC-MS/MS的靶向代谢组学方法，可同时定量120种肠道菌群衍生代谢物（包括短链脂肪酸、吲哚类、核苷酸、有机酸及氨基酸衍生物）。该方法采用多反应监测（MRM）模式和52种同位素标记内标，实现了在0.45 pmol至1 nmol范围内的绝对定量，并成功应用于不同样本矩阵（血浆、肝脏、粪便、肠道内容物）及DNA稳定缓冲液保存的样本中，为研究微生物-宿主代谢互作提供了可靠工具。

　　

在人体肠道中，数以万亿计的微生物构成一个复杂的生态系统，它们通过发酵膳食成分、合成新化合物或转化营养物质，产生大量小分子代谢物。这些代谢物不仅参与宿主的消化和生理调节，还在代谢性疾病、心血管疾病、癌症等多种疾病的发生发展中发挥关键作用。例如，短链脂肪酸（SCFAs）如乙酸、丙酸和丁酸，是肠道细菌发酵膳食纤维的主要产物，能够为肠上皮细胞和肝细胞提供能量，并参与免疫调节。此外，由色氨酸转化而来的吲?哚类物质（如吲哚-3-丙酸）以及由谷氨酸衍生的γ-氨基丁酸（GABA）等，都是肠道菌群与宿主间重要的信号分子。然而，由于这些代谢物化学性质多样、挥发性高，且在不同生物样本（如粪便、血浆、组织）中浓度差异大，其准确定量一直面临技术挑战。尤其在许多临床微生物组研究中，样本常保存在DNA/RNA稳定缓冲液中，其中的去污剂、高盐等添加剂常干扰液相色谱分析，进一步增加了代谢物检测的难度。

为系统量化肠道菌群代谢产物，Nikita Denisov、Fabian Springer等研究人员在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》上发表了题为“Development of a GC-MS/MS method to quantify 120 gut microbiota-derived metabolites”的研究论文。该研究建立了基于气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）的靶向代谢组学方法，实现了对120种肠道菌群衍生代谢物的绝对定量，覆盖了短链脂肪酸、支链脂肪酸、有机酸、氨基酸及其衍生物、吲哚类等多个化学类别。方法采用同位素稀释技术和多反应监测（MRM）模式，具有高灵敏度、宽线性范围和良好的精密度，并成功应用于不同生物样本（包括血浆、肝脏、肠道内容物等）以及DNA稳定缓冲液保存的样本中，为微生物-宿主代谢互作研究提供了强有力的分析工具。

研究中主要关键技术方法包括：1）样本前处理采用珠磨破碎法进行代谢物提取，提取溶剂为水:乙腈:甲醇（25:50:50, v/v/v）混合溶液；2）代谢物衍化采用甲氧胺盐酸盐和N-叔丁基二甲基硅基-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）进行甲肟化和硅烷化反应，以增强代谢物的挥发性和热稳定性；3）GC-MS/MS分析使用Zebron ZB-5ms色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），采用多反应监测（MRM）模式对120种目标代谢物及52种同位素标记内标进行检测；4）方法验证采用无特定病原体（CONV）和无菌（GF）C57BL/6J小鼠的血浆、肝脏、粪便及不同肠段内容物等生物样本，并考察了方法灵敏度、线性范围、精密度以及在不同DNA稳定缓冲液（如Invitek、OMNIgene gut）中的兼容性。

方法灵敏度与线性范围

研究通过稀释系列实验确定了各代谢物的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。结果显示，有机酸、脂质等代谢物的LOQ低至0.45 pmol，短链脂肪酸（SCFAs）的LOQ为12.34 pmol，氨基酸及其衍生物的LOQ为0.15 pmol。各代谢物的线性定量范围覆盖0.45 pmol至1000 pmol，且通过同位素内标校正进一步拓宽了定量范围。

方法精密度与准确性

通过考察日内和日间精密度，研究人员验证了方法在不同样本矩阵（血浆、盲肠内容物）中的重复性。所有代谢物的变异系数（CV）均小于20%，符合生物分析方法的验证要求。此外，通过分析标准参考物质（NIST SRM 1950血浆），发现测得的代谢物浓度与参考值高度一致，证明了方法的准确性和可靠性。

微生物代谢物的组织分布特征

将方法应用于无菌（GF）和常规饲养（CONV）小鼠的样本中，研究人员成功定量了81种血浆代谢物和73种肝脏代谢物。在CONV小鼠血浆中，10种代谢物为微生物特异性产物（如吲哚乙酸、吲哚丙酸），40种代谢物在两组间存在显著差异。在肝脏样本中，3种代谢物（马尿酸、辛二酸、色胺）仅在CONV小鼠中检测到，而12-羟基硬脂酸仅存在于GF小鼠，反映了微生物对宿主代谢的显著影响。

肠道内容物中代谢物的空间分布

通过分析小鼠不同肠段（十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、粪便）的内容物，研究人员发现盲肠是微生物代谢最活跃的区域，共定量到82种代谢物。其中，57种代谢物在CONV和GF小鼠间存在显著差异，如乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸在CONV小鼠盲肠中显著富集，而某些氨基酸（如丝氨酸）在GF小鼠远端结肠中浓度较高，反映了微生物对营养素的消耗和转化。

与DNA/RNA稳定缓冲液的兼容性

研究还评估了方法在两种常用DNA/RNA稳定缓冲液（Invitek、OMNIgene gut）中的适用性。结果显示，绝大多数代谢物在稳定缓冲液中仍可准确定量，仅少数代谢物（如异己酸、2-酮异己酸）在Invitek缓冲液中未被检测到。这表明该方法适用于临床样本中代谢物的检测，为微生物组与代谢组数据的整合分析提供了可能。

本研究成功开发了一种基于GC-MS/MS的靶向代谢组学方法，实现了对120种肠道菌群衍生代谢物的同时定量。方法具有高灵敏度、宽线性范围和良好的精密度，适用于多种生物样本矩阵（血浆、肝脏、肠道内容物等），且与DNA/RNA稳定缓冲液兼容。通过应用于无菌和常规饲养小鼠的样本，研究揭示了微生物对宿主代谢的显著影响，并展示了方法在空间分辨率下捕捉微生物代谢活动的潜力。该方法为肠道菌群-宿主代谢互作研究提供了强大的分析工具，有望促进微生物组与代谢组数据的整合，推动相关疾病机制研究和治疗策略开发。