腺相关病毒载体Dp12S疫苗有效缓解小鼠哮喘症状

《npj Vaccines》：The adeno associated viral vectored Dp12S vaccine effective alleviation of asthma symptoms in mice

本研究针对过敏性哮喘现有疗法仅能缓解症状、无法阻断疾病进程的难题，开发了一种基于腺相关病毒(AAV)载体递送屋尘螨(HDM)主要过敏原Der p1和Der p2的融合蛋白疫苗(AAV-Dp12S)。研究证实，该疫苗能有效减轻小鼠模型中的气道高反应性(AHR)、肺部嗜酸性粒细胞浸润及黏液过度分泌，并通过调节Th1/Th2免疫平衡、降低特异性IgE水平、诱导保护性IgG抗体和抗炎细胞因子，展现出良好的治疗潜力，为过敏性哮喘的基因治疗提供了新策略。

　　

过敏性哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，全球有数亿人受其困扰，其中屋尘螨是引发该病最主要的过敏原之一。当前的治疗方法，如糖皮质激素和支气管扩张剂，大多只能暂时控制症状，属于“治标不治本”的姑息疗法。患者迫切需要能够从根本上调节异常免疫反应、甚至诱导免疫耐受的新疗法。过敏原特异性免疫治疗(AIT)是一种有前景的对因治疗策略，但传统的基于过敏原提取物的疫苗存在成分复杂、标准化困难以及可能引发严重过敏反应的风险。因此，开发基于明确重组过敏原、安全性更高、疗效更持久的新型疫苗成为该领域的研究热点。

在此背景下，一篇发表在《npj Vaccines》上的研究论文《The adeno associated viral vectored Dp12S vaccine effective alleviation of asthma symptoms in mice》为我们带来了新的希望。该研究由刘胜斌、秦树刚等人合作完成，他们巧妙地利用基因工程和病毒载体技术，构建了一种新型的AAV载体疫苗，并在小鼠模型中验证了其治疗过敏性哮喘的有效性。

研究人员开展此项研究主要运用了几个关键技术方法：首先，他们通过分子设计构建了低过敏性的屋尘螨主要过敏原Der p1和Der p2的融合蛋白Dp12S，并利用AAV6.2FF血清型载体（一种对肺组织有特殊亲和力的病毒载体）进行包装。其次，他们通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(WB)和点杂交等技术，在体外评估了Dp12S蛋白与过敏性患者血清中IgE抗体的结合能力（即免疫反应性）。此外，研究还利用了屋尘螨诱导的小鼠过敏性哮喘模型，通过气道内接种AAV-Dp12S疫苗，并综合运用肺功能检测、组织病理学分析、流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)以及定量聚合酶链式反应(qPCR)等多种技术手段，全面评估了该疫苗对哮喘关键病理指标的影响。本研究中所用的人外周血单个核细胞(PBMC)来自明确诊断为屋尘螨过敏的志愿者和非过敏的健康对照者。

Construction and Characterization of AAV Vector Carrying Der p1-Der p2 Antigens

研究人员首先成功构建了携带Der p1和Der p2融合基因的AAV载体（AAV-Dp12S）。他们对融合蛋白进行了精心设计，包括使用前肽形式的Der p1以增强表达和降低免疫反应性，并将分子内的12个半胱氨酸残基替换为丝氨酸残基，旨在减少因二硫键错误配对导致的蛋白聚集，从而进一步降低其引发过敏反应的风险。他们还在蛋白的N端和C端分别添加了HA标签和Flag标签以便于检测。连接Der p1和Der p2的是一段具有自切割功能的2A肽 linker，期望在表达后能产生两个独立的过敏原蛋白。实验证实，该融合蛋白能在人支气管上皮细胞(BEAS-2B)和人胚胎肾细胞(HEK-293)中有效表达，并能被抗Der p1和抗Der p2的特异性抗体识别。值得注意的是，2A肽的自切割效率并非100%，因此在细胞中也能检测到完整的融合蛋白形式。

Dp12S Exhibits Lower IgE Reactivity Than Parental Allergens and Allergen Extract in D.pteronyssinus Reactive Sera

安全性是过敏疫苗的首要考量。研究团队利用屋尘螨过敏患者的血清进行检测，发现重组Dp12S蛋白与免疫球蛋白E(IgE)的结合能力显著低于天然的Der p1、Der p2蛋白以及屋尘螨粗提物(DpE)。这表明通过基因工程改造获得的Dp12S确实具有“低过敏性”，即其直接引发过敏反应的风险大大降低，为其作为治疗疫苗的安全性提供了重要依据。

PBMCs from Allergic Individuals Stimulated with Dp12S Show High Levels of Regulatory and Th1 Cytokines

为了探究Dp12S对免疫细胞的影响，研究人员用该蛋白刺激过敏患者的外周血单个核细胞(PBMCs)。结果发现，与未刺激的细胞相比，Dp12S能诱导PBMCs产生更高水平的干扰素-γ(IFN-γ，一种Th1型细胞因子)、白细胞介素-2(IL-2)和具有抗炎活性的白细胞介素-10(IL-10)，同时降低了Th2型细胞因子（如IL-4, IL-5, IL-13）的水平。这种细胞因子谱的转变（从促炎的Th2偏向转向抗炎的Th1/调节性偏向）是过敏原免疫治疗起效的关键标志，提示Dp12S具有调节异常免疫应答的潜力。

AAV6.2FF-mediated transgene expression in mouse lungs

在将疫苗应用于动物模型前，研究人员先验证了所选用的AAV6.2FF载体能否有效地将外源基因递送至并表达于小鼠肺部。通过气管内(IT)或滴鼻(IN)途径给予携带荧光素酶报告基因的AAV载体(AAV-Luc)，活体成像结果显示，两种方式均能在肺部实现长期（持续30周）的转基因表达，且气管内给药的效果更强，靶向性更好。后续实验也证实，通过气管内注射AAV-Dp12S，能在小鼠肺组织中有效检测到Der p1和Der p2蛋白的表达。

AAV-Dp12S Immunization Reduces AHR and Eosinophilia and Induces Macrophage Proliferation in HDM-Induced Asthmatic Mice

在屋尘螨致敏的小鼠哮喘模型中，评估AAV-Dp12S的治疗效果是研究的核心。结果显示，与仅致敏的哮喘模型组或接受空载体(AAV-GFP)处理的对照组相比，提前通过气管内接种AAV-Dp12S疫苗的小鼠，在吸入乙酰甲胆碱(MCh)后所表现出的气道高反应性(AHR)显著降低。流式细胞术分析发现，AAV-Dp12S治疗能显著减少肺部浸润的嗜酸性粒细胞数量，同时增加巨噬细胞的比例，且并未引起中性粒细胞增多。支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞计数结果也与此一致。这些结果表明AAV-Dp12S能有效抑制哮喘特征性的肺部炎症细胞浸润。

AAV-Dp12S Treatment Reduces IgE Production in Mice Allergic to D. pteronyssinus

过敏的标志是IgE水平升高。本研究显示，AAV-Dp12S治疗能显著降低屋尘螨攻击后小鼠血清中的总IgE水平以及BALF中的屋尘螨特异性IgE(sIgE)水平。与此同时，疫苗却诱导产生了高水平的屋尘螨特异性IgG1和IgG2a抗体。这种IgE下降而IgG（尤其是可能具有“阻断抗体”功能的IgG）上升的抗体谱，是免疫治疗成功的另一个重要免疫学特征，可能通过竞争性抑制过敏原与IgE的结合，从而发挥保护作用。

AAV-Dp12S Immunization Ameliorates Pulmonary Inflammation and Mucus Overproduction

组织病理学检查直观地展示了AAV-Dp12S的治疗益处。肺组织切片经苏木精-伊红(H&E)染色显示，疫苗治疗显著减轻了哮喘小鼠支气管和血管周围的炎症细胞浸润。过碘酸雪夫(PAS)染色则表明，哮喘模型中常见的杯状细胞增生和黏液过度分泌现象，在AAV-Dp12S治疗组中也得到了明显抑制。此外，肺组织中与炎症（如肿瘤坏死因子-α(TNF-α), IL-1β, IL-6）和黏液分泌（如Gob5）相关的基因表达水平也因治疗而降低。

AAV-Dp12S Immunization Modulates Th2 Cytokines and Induces IL-10 and IFN-γ

对BALF和脾细胞培养上清液的细胞因子检测进一步从分子层面揭示了AAV-Dp12S的免疫调节机制。疫苗治疗使BALF中Th2型细胞因子(IL-4, IL-5, IL-13)的水平下降，而抗炎细胞因子IL-10和Th1型细胞因子IFN-γ的水平上升。当用屋尘螨提取物或重组的Dp12S蛋白再次刺激小鼠脾细胞时，也观察到了类似的细胞因子变化模式，即IL-10和IFN-γ分泌增加，而IL-4, IL-5, IL-13分泌减少。这强有力地说明AAV-Dp12S疫苗接种诱导了一种有利于抑制过敏炎症的免疫偏移。

AAV-Dp12S Immunization Suppresses iNOS Expression and Improves Lung Function

诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及其产物一氧化氮(NO)在哮喘的气道炎症中扮演重要角色。本研究通过免疫荧光、qPCR和WB等多种方法证实，AAV-Dp12S治疗能显著抑制屋尘螨攻击引起的肺组织iNOS表达上调。利用强迫振荡技术进行的肺功能检测表明，AAV-Dp12S治疗改善了哮喘小鼠的多种肺功能参数，包括降低了中心气道阻力(R_n)、组织阻尼(G)和组织弹性(H)，说明疫苗治疗不仅缓解了炎症，还切实改善了肺的生理功能。

结论与讨论

本研究成功开发了一种基于AAV载体的、靶向屋尘螨主要过敏原Der p1和Der p2的新型治疗性疫苗AAV-Dp12S。综合研究结果表明，该疫苗具有低过敏性，能安全有效地递送至肺部并长期表达。在屋尘螨诱导的小鼠哮喘模型中，AAV-Dp12S展现出多方面的治疗效益：它能显著缓解气道高反应性和肺部炎症，减少黏液分泌，改善肺功能。其作用机制与调节Th1/Th2免疫平衡、降低致病性IgE、诱导可能具有保护作用的IgG抗体以及上调抗炎细胞因子IL-10等相关。

该研究的创新之处在于首次将AAV载体应用于屋尘螨过敏原的递送，并验证了其在哮喘模型中的治疗潜力。AAV载体具有免疫原性低、转基因表达持久、宿主范围广等优点。研究所设计的Dp12S融合蛋白通过分子工程改造，有效降低了IgE结合能力，提高了安全性。虽然气管内给药在临床转化上存在挑战，但本研究为AAV载体在呼吸道过敏性疾病基因治疗中的应用提供了强有力的临床前概念验证。未来研究可探索更易于临床实施的给药途径（如肌肉注射），并进一步评估其长期疗效和安全性。总之，AAV-Dp12S作为一种兼具耐受诱导和预防接种潜力的策略，为过敏性哮喘的精准治疗开辟了新的途径，具有重要的科学意义和临床转化价值。