Wnt2通过Lrp6/Trim11介导的Nap1L1降解通路激活抗氧化基因转录以保护心脏缺血再灌注损伤的新机制

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Nucleosome assembly protein-like 1 degradation-dependent novel cardioprotection mechanism of Wnt2 against ischemia?reperfusion injury

本研究针对心肌缺血再灌注(I/R)损伤缺乏有效治疗策略的临床难题，发现Wnt2在急性心肌梗死(AMI)患者经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后血清水平显著降低且与心肌损伤标志物(cTnT/CK-MB)负相关。研究人员通过动物实验证实重组人Wnt2蛋白(rbWnt2)可通过Lrp6/Trim11轴促进核小体组装蛋白样蛋白1(Nap1L1)的泛素化降解，解除其对抗氧化反应元件(ARE)的转录抑制，进而激活SOD/GPX/UCP3等抗氧化基因表达，显著降低ROS水平并抑制心肌细胞凋亡与铁死亡。该研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，为靶向氧化损伤的精准治疗提供了新策略。

　　

当心脏的血液供应突然中断，即发生急性心肌梗死时，及时恢复血流是挽救心肌的关键。然而， paradoxically，再灌注过程本身会引发额外的心肌损伤，这就是医学上棘手的缺血再灌注损伤。这种损伤涉及复杂的代谢紊乱、离子失衡和炎症反应，严重限制了血运重建治疗的获益。目前，临床上仍缺乏有效干预心肌缺血再灌注损伤的手段。

在探索心脏保护策略的过程中，Wnt信号通路逐渐进入研究者的视野。Wnt蛋白在动物中高度保守，广泛表达于各种组织，通过激活卷曲蛋白家族受体(FZDs)和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5/6触发Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号转导，参与调控器官缺血再灌注损伤。有趣的是，本研究团队前期发现，急性心肌梗死患者血清中Wnt2和Wnt4水平较健康对照升高，但经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后，只有Wnt2水平显著降低，且与心肌损伤程度负相关。

核小体组装蛋白样蛋白1(Nap1L1)作为组蛋白分子伴侣，在核输入H2A-H2B和核小体组装中起重要作用。本研究团队前期工作表明，Nap1L1促进P19CL6细胞向心肌细胞分化，其敲低可通过Notch信号诱导小鼠诱导多能干细胞中胚层形成和心肌发生。然而，Nap1L1在心血管疾病，特别是心脏缺血再灌注损伤中的作用和分子机制尚不清楚。

本研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，揭示了Wnt2通过新型Lrp6/Trim11/Nap1L1轴在心脏缺血再灌注损伤中的保护作用机制。研究人员发现，在临床急性心肌梗死队列和实验性缺血再灌注小鼠模型中，Wnt2动态下调并与心肌损伤严重程度负相关。通过多组学和遗传学方法，他们证明重组Wnt2蛋白通过抑制ROS触发的凋亡和铁死亡，提供强劲的心脏保护作用。

关键技术方法包括：从急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者队列获取血清样本进行ELISA检测；建立小鼠心脏缺血再灌注模型并通过微型渗透泵持续输注重组人Wnt2蛋白；采用蛋白质组学(TMT6标记)分析差异表达蛋白；通过腺相关病毒(AAV9)介导的心肌特异性Nap1L1基因敲低和过表达；应用超声心动图应变分析评估心功能；利用免疫共沉淀和染色质免疫沉淀技术验证蛋白相互作用和DNA结合活性。

Wnt2与心脏I/R损伤负相关

研究人员首先评估了急性心肌梗死患者血清Wnt2水平的动态变化。发现与再灌注前相比，PCI后第1-4天血清Wnt2水平进行性下降，且与心肌损伤标志物cTnT和CK-MB水平负相关。在小鼠I/R模型中，血清和心脏Wnt2水平呈现类似的下调趋势，而Wnt4表达无显著变化。这种Wnt2下调特异性地定位于缺血区域，在分离的心肌细胞和心脏成纤维细胞中同样观察到缺氧/复氧(H/N)诱导的Wnt2表达和分泌减少。

rbWnt2干预显著减轻心脏I/R损伤

通过微型渗透泵给与重组人Wnt2蛋白(rbWnt2)干预，发现rbWnt2处理显著改善I/R模型小鼠的心功能，表现为左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(LVFS)增加。应变分析显示rbWnt2提高整体和梗死区峰值收缩应变，降低最大对壁延迟(MOWD)。Evans blue/TTC双染证实rbWnt2预处理显著减小心肌梗死面积，同时保存心脏ATP水平。在体外人心肌细胞实验中，rbWnt2处理逆转H/N诱导的内源性Wnt2和ATP水平下降。

RbWnt2改善心肌I/R损伤过程中的心肌细胞死亡

TUNEL染色显示rbWnt2处理显著减少I/R后TUNEL阳性核数量，抑制促凋亡标志物(cleaved caspase-3、caspase-3、Bax)激活，恢复抗凋亡Bcl-2表达。rbWnt2预处理显著缓解铁死亡诱导剂RSL3和Erastin引起的心肌细胞活力下降。在I/R模型中，rbWnt2减少心脏非血红素铁沉积，降低脂质过氧化标志物(Acrolein、Acsl4、MDA)水平，恢复Gpx4表达。值得注意的是，rbWnt2对Ripk1/Ripk3磷酸化或GSDMD-NT断裂无抑制作用，表明其不影响I/R诱导的坏死或焦亡。

Wnt2通过激活抗氧化基因转录降低I/R心脏中的ROS水平

蛋白质组学分析发现rbWnt2处理心脏中差异表达蛋白显著富集于ROS代谢通路。体内外实验证实rbWnt2处理显著减弱I/R损伤心脏组织和H/N刺激心肌细胞中ROS积累。rbWnt2通过显著提高ROS清除基因(Sod1、Sod2、Sod3、Gpx1、Gpx4、HO1、Gclm、Glpx和Ucp3)的转录水平，恢复Ucp3、Sod1、Sod2和Gpx1蛋白表达，而不影响MAO、ETC、MCU和NOX等ROS产生相关基因mRNA水平。

Wnt2下调Nap1L1重新激活I/R心脏中的抗氧化基因转录

研究发现rbWnt2介导的心脏保护作用不依赖于经典Wnt/β-catenin信号通路。生物信息学分析显示抗氧化酶水平与Nap1L1表达呈负相关趋势。rbWnt2处理显著减弱I/R诱导的Nap1L1上调，抑制H/N引起的Nap1L1在核和胞质中的积累。心肌特异性Nap1L1敲低模拟了rbWnt2的抗氧化作用，而Nap1L1过表达阻断rbWnt2抑制ROS水平和诱导抗氧化蛋白的能力。机制上，H/N增强Nap1L1在含保守抗氧化反应元件(ARE)的抗氧化基因启动子上的占据，rbWnt2处理减弱这种结合。

Nap1L1下调介导Wnt2对凋亡和铁死亡的双重抑制作用

Nap1L1敲低显著减少H/N处理心肌细胞和I/R损伤心脏中TUNEL阳性核数量，抑制caspase-3激活，提高RSL3处理心肌细胞活力，降低脂质过氧化标志物水平和铁沉积，恢复Gpx4表达。相反，Nap1L1过表达取消rbWnt2对I/R损伤过程中凋亡的抑制作用，逆转rbWnt2介导的MDA/Acrolein/Acsl4水平降低和铁积累减少，恢复Gpx4水平。

Nap1L1调控对Wnt2的心脏保护作用至关重要

Nap1L1过表达阻断rbWnt2对心功能(LVEF、LVFS、应变参数)的改善作用，逆转rbWnt2诱导的梗死面积减小。而Nap1L1沉默模拟rbWnt2效应，显著提高I/R后心功能和应变参数，减小梗死面积。ATP产生实验显示Nap1L1敲低改善H/N心肌细胞或I/R心脏中降低的ATP水平，而Nap1L1过表达减弱rbWnt2在H/N心肌细胞或I/R心脏中诱导的ATP水平增加。

RbWnt2通过Lrp6促进Trim11介导的Nap1L1降解

研究发现rbWnt2处理逆转I/R后Nap1L1泛素化水平下降。UbiBrowser分析鉴定Trim11和Rapsn为Nap1L1的顶级E3连接酶候选分子。rbWnt2特异性逆转H/N诱导的Trim11下调，恢复Trim11与Nap1L1的相互作用。Trim11沉默阻断rbWnt2干预介导的Nap1L1泛素化增加。进一步实验证实rbWnt2通过Lrp6而非Fzd2招募Trim11调控Nap1L1泛素化降解。

本研究通过临床队列和实验模型证实Wnt2在心脏缺血再灌注损伤中动态下调的病理意义，首次揭示重组Wnt2蛋白通过Lrp6/Trim11轴促进Nap1L1泛素化降解，解除其对ARE依赖性转录的抑制，重新激活抗氧化基因表达，从而协调抑制氧化应激和多种细胞死亡模式的心脏保护机制。这一Wnt2-Lrp6/Trim11-Nap1L1轴的发现不仅深化了对缺血再灌注损伤病理机制的理解，更重要的是为开发靶向区室化氧化损伤的精准治疗策略提供了新思路。

研究的意义在于将Wnt2重新定义为通过Nap1L1介导的转录重编程调控缺血再灌注损伤的关键分子，为解决血运重建治疗后心肌保护这一未满足的临床需求提供了机制基础。值得注意的是，Wnt2信号在心脏病理生理中表现出阶段依赖性双重调控：在缺血再灌注早期通过Lrp6-Nap1L1轴发挥急性心脏保护作用，而在慢性心肌梗死中可能通过持续升高促进纤维化。这种时空特异性提示在PCI期间临时性rbWnt2给药可能最大化急性保护效益同时避免促纤维化效应，为临床转化提供了重要参考。