乙胺嗪通过激活异源表达的马来丝虫TRP-2b通道引发HEK293细胞钙信号

《Scientific Reports》：Diethylcarbamazine elicits calcium signals by activation of Brugia malayi TRP-2b channels heterologously expressed in HEK293 cells

本研究针对经典抗丝虫药乙胺嗪(DEC)作用机制不清的问题，探讨了其是否直接激活马来丝虫(Brugia malayi) TRP-2b通道。研究人员通过在HEK293细胞中异源表达Bma-TRP-2b，利用钙成像技术发现DEC可特异性激活该通道引起钙内流，此效应可被TRPC拮抗剂SKF96365抑制，且能被卡巴胆碱(carbachol)预处理的钙微域增强。结果表明DEC的直接靶点是寄生虫TRP-2通道，同时提示其对宿主TRPC通道的激活可能参与免疫调节，为阐明DEC的双重作用机制提供了新视角。

　　

淋巴丝虫病是一种被忽视的热带疾病，由班氏丝虫、马来丝虫和帝汶丝虫引起，全球有超过6.57亿人受到威胁。尽管有药物治疗方案，但针对成虫的特效药有限，且乙胺嗪(Diethylcarbamazine, DEC)这一经典药物的作用机制数十年来一直模糊不清。传统观点认为DEC主要通过刺激宿主免疫系统来清除微丝蚴，而非直接作用于寄生虫。然而，近年来的研究开始挑战这一观点，发现DEC能引起成虫肌肉的暂时性强直性瘫痪，这提示其可能存在直接靶点。

为了揭开DEC作用机制的神秘面纱，Paul D.E. Williams、Sudhanva S. Kashyap、Alan P. Robertson和Richard J. Martin等研究人员将目光投向了瞬时受体电位(Transient Receptor Potential, TRP)通道，特别是马来丝虫的TRPC通道同源物TRP-2。先前在寄生虫肌肉组织中的研究表明，DEC能激活TRP-2通道，产生内向电流并增加细胞内钙离子浓度，导致肌肉收缩。那么，这种激活作用是否特异性地依赖于TRP-2通道本身？为了回答这个关键问题，研究团队进行了一项精巧的实验：他们将马来丝虫TRP-2b通道在人类胚胎肾(Human Embryonic Kidney, HEK293)细胞中进行异源表达，直接观察DEC对这种"纯化"系统的影响。这项研究发表在《Scientific Reports》上，为理解DEC的药理作用提供了新的见解。

研究人员主要运用了几项关键技术：通过分子克隆技术在HEK293细胞中异源表达带有mCardinal荧光标签的马来丝虫TRP-2b(Bma-TRP-2b)通道；利用RT-PCR技术检测细胞中内源性TRP通道的表达；采用钙成像技术，以Fluo-3AM作为钙离子荧光指示剂，实时监测细胞内钙信号变化；应用药理学方法，使用TRPC通道拮抗剂SKF96365进行阻断实验。研究所用的马来丝虫成虫来自美国国立卫生研究院/国家过敏和传染病研究所(NIH/NIAID)丝虫病研究试剂资源中心。

TRPC表达在HEK293细胞中

研究人员首先确认了HEK293细胞表达内源性TRP通道的情况。RT-PCR分析显示，非转染的HEK293细胞表达TRPC1、TRPC3、TRPC4和TRPC6，但不表达TRPC2或TRPC5，这与文献报道一致。在转染了Bma-trp-2b的HEK293细胞中，除了检测到四种内源性TRPC通道外，还成功检测到寄生虫TRP-2b通道的表达。通过mCardinal红色荧光标记，研究人员能够直观地筛选出成功转染的细胞进行后续实验。

乙胺嗪刺激Bma-trp-2b转染细胞中的Ca²⁺信号

实验的核心发现是：应用30μM DEC处理Bma-trp-2b转染的HEK293细胞5分钟，可引发明显的钙信号，平均峰值振幅增加28%(±2.7%)。然而，只有约三分之一(33%±6.6%)的转染细胞对DEC产生可检测的钙响应。相比之下，非转染细胞对DEC的反应微弱得多(平均增幅仅1%，仅5%细胞有响应)。所有细胞对10 mM CaCl₂对照刺激均产生强烈反应，证明细胞活性和钙探针功能正常。这一结果明确显示，DEC诱导的钙信号依赖于马来丝虫TRP-2b通道的存在。

卡巴胆碱增强乙胺嗪信号

为什么只有部分转染细胞对DEC产生响应？研究人员推测这可能与细胞内钙微域的差异有关。他们使用卡巴胆碱(10μM)预处理细胞，激活Gq蛋白偶联的毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)，从而通过磷脂酶C(PLC)途径增加细胞内钙浓度。果然，卡巴胆碱预处理后，响应DEC的Bma-trp-2b转染细胞比例从33%显著提升至90%，虽然平均峰值振幅(32%±2.2%)与未预处理组相似。在非转染细胞中，卡巴胆碱预处理也能增强DEC反应，但幅度(10%±0.5%)和响应细胞比例(22%±6.2%)均显著低于转染细胞。这表明钙微域的增强作用对TRP通道的功能至关重要，且Bma-TRP-2b对DEC的敏感性远高于哺乳动物内源性TRP通道。

花生四烯酸刺激Bma-TRP-2b通道促进钙内流

花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)是TRP通道的已知激活剂。应用30μM AA于卡巴胆碱预处理的Bma-trp-2b转染细胞，可引发平均16%(±0.7%)的钙信号，71%(±4.1%)的细胞产生响应。非转染细胞对AA的反应则较弱(平均增幅10%，仅34%细胞响应)。这与DEC的实验结果模式相似，进一步支持了Bma-TRP-2b通道可被多种刺激激活的特性，且其对AA的敏感性也高于内源性TRP通道。

SKF-96365抑制HEK293细胞中DEC介导的钙信号

为确证DEC信号的特异性，研究人员使用了TRPC通道拮抗剂SKF96365。在卡巴胆碱预处理的Bma-trp-2b转染细胞中，应用10μM SKF96365可几乎完全抑制30μM DEC引发的钙信号(平均振幅降至1.5%±0.1%)。洗脱SKF96365后，DEC反应有部分恢复。在非转染细胞中，SKF96365也能抑制DEC引发的微弱钙信号。SKF96365的抑制效应为"DEC通过TRP通道发挥作用"这一假设提供了强有力的药理学证据。

讨论与结论

这项研究系统地证实了乙胺嗪的直接分子靶点是马来丝虫TRP-2b通道。通过在HEK293细胞中的异源表达体系，研究人员成功地将寄生虫TRP通道从复杂的体内环境中"剥离"出来，清晰展示了DEC对其的特异性激活作用。卡巴胆碱预处理显著提高响应细胞比例的现象，揭示了TRP通道功能受细胞内钙微域精细调控的特性，这解释了为何在天然组织中DEC效应更为一致——因为体内存在着持续的内源性调节信号。

特别值得注意的是，DEC也能微弱激活HEK293细胞的内源性哺乳动物TRP通道，且此效应同样可被SKF96365抑制。这一发现具有重要启示：DEC可能通过双重机制发挥抗丝虫作用——直接瘫痪寄生虫肌肉，同时激活宿主免疫细胞的TRP通道。已知TRP通道在巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞中表达，参与炎症反应和细胞因子分泌。DEC对宿主免疫细胞TRP通道的激活，可能解释其长期观察到的免疫刺激效应，如促进粒细胞粘附、改变前列腺素代谢等。

此外，花生四烯酸与DEC相似的激活效应，提示寄生虫可能利用宿主来源的花生四烯酸及其代谢物作为内源性TRP通道调节剂，而DEC可能模拟或干扰这一通路。

这项研究不仅阐明了DEC抗丝虫作用的直接靶点，为合理药物设计提供了分子基础，还提出了DEC通过激活宿主TRP通道调节免疫反应的新假说，为理解这类经典药物的多重药理作用开辟了新视角。对TRP通道在宿主-寄生虫相互作用中角色的深入探索，可能为抗寄生虫药物研发带来新的策略。