阿帕替尼通过激活STAT1/NK轴增强PD-1抑制剂在晚期肝细胞癌中的疗效

《Scientific Reports》：Apatinib-Induced STAT1/NK axis activation augments PD-1 inhibitor efficacy in advanced Hepatocellular Carcinoma

本研究针对晚期肝细胞癌(HCC)患者对PD-1抑制剂单药治疗反应不佳的临床难题，探讨了阿帕替尼联合PD-1抑制剂的协同抗肿瘤机制。研究发现阿帕替尼可通过激活STAT1/NK细胞轴，显著增强PD-1抑制剂的疗效，并重塑肿瘤免疫微环境，为联合治疗方案提供了重要的理论依据。

　　

在全球癌症相关死亡原因中，肝细胞癌(HCC)位居第三，其恶性程度高、预后差。尽管手术切除是根治性治疗的主要手段，但超过70%的患者在确诊时已处于不可切除的晚期阶段。近年来，以程序性死亡蛋白1(PD-1)抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂(ICIs)在HCC治疗中取得了显著进展，为患者带来了生存获益。然而，原发性耐药和获得性耐药依然是临床面临的严峻挑战，大多数患者无法从免疫单药治疗中持续获益。这种治疗反应的异质性与肿瘤微环境(TME)的免疫抑制状态密切相关，其特征包括功能失调的细胞毒性T细胞、丰富的调节性T细胞(Tregs)以及抗原呈递功能受损。为了克服耐药，研究者们将目光投向了联合治疗策略，特别是与抗血管生成药物的联合，以期逆转免疫细胞在肿瘤组织中的血管排斥现象。

在这其中，信号转导与转录激活因子1(STAT1)通路是调节肿瘤微环境免疫原性的关键分子。STAT1的激活可以通过增强干扰素-γ(IFN-γ)信号通路来促进抗肿瘤免疫，这一机制在多种恶性肿瘤中均得到证实。例如，在黑色素瘤中，STAT信号通路与肿瘤内CD8⁺T细胞浸润增加以及接受抗PD-1治疗后的无进展生存期(PFS)延长相关。类似地，STAT1高表达的乳腺癌患者对免疫检查点抑制剂的客观缓解率也更高。从机制上讲，STAT1调控主要组织相容性复合物I/II类分子和趋化因子的转录，促进树突状细胞成熟和自然杀伤(NK)细胞招募。因此，促进STAT1的激活可能有效增强免疫反应和免疫检查点抑制剂的疗效。然而，STAT1在肝细胞癌免疫生物学中的作用仍未被充分探索，激活STAT1通路以克服PD-1耐药的方法及其效果仍需深入研究。

阿帕替尼是一种选择性血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)抑制剂，已获批用于治疗晚期肝细胞癌。除了抑制血管生成，研究显示阿帕替尼还具有独特的免疫调节特性，能够改变IFN-γ的水平。而IFN-γ是STAT的关键激活剂，激活的STAT1已被证明可以增强NK细胞对肝细胞癌的抗肿瘤功能。在阿帕替尼联合PD-1抑制剂治疗广泛期小细胞肺癌的患者中，STAT1的激活与NK细胞水平升高和PFS延长显著相关。这些发现与CARES-310临床试验的观察结果一致，该试验中阿帕替尼联合卡瑞利珠单抗相比索拉非尼获得了前所未有的中位总生存期获益。尽管联合疗法在临床上显示出前景，但其协同作用的分子机制大多基于经验证据，从临床前数据深入探讨其免疫治疗协同机制的研究有限。基于此，本研究提出假设：阿帕替尼通过激活STAT1/NK通路，可能是克服PD-1抑制剂耐药性的潜在机制。

为了验证这一科学假设，来自福建医科大学孟超肝胆医院的研究团队开展了一项深入的研究，相关成果发表在《Scientific Reports》上。研究人员综合利用体外细胞实验和体内动物模型，旨在阐明阿帕替尼增强PD-1抑制剂抗肝细胞癌疗效的具体分子机制。

本研究主要应用了几项关键技术方法：通过细胞活力检测、克隆形成实验和流式细胞术评估阿帕替尼对HCC细胞系（Hepa1-6和Hep 53.4）的直接抑制作用；构建小鼠HCC皮下移植瘤模型，进行体内药效评价和生存分析；利用蛋白质印迹法(Western blot)、免疫组织化学和免疫荧光技术检测肿瘤组织中STAT1、CD8⁺T细胞、NK细胞以及肿瘤微环境相关标志物（CA IX、CD31、α-SMA）的表达和分布；通过构建STAT1过表达(STAT1-OE)的Hepa1-6细胞株，并使用STAT1抑制剂氟达拉滨(Fludarabine)和NK细胞清除剂Asialo GM1进行功能丧失实验，验证STAT1/NK轴在联合疗法中的关键作用。

阿帕替尼对肝癌细胞的抑制作用

研究人员首先在体外评估了阿帕替尼对肝癌细胞的直接作用。研究结果显示，阿帕替尼能显著抑制Hepa1-6和Hep 53.4细胞的活力。在处理24小时后，与对照组相比，阿帕替尼处理组的活细胞数量明显减少。此外，克隆形成实验表明，阿帕替尼处理显著降低了肝癌细胞形成集落的能力。流式细胞术检测细胞凋亡的结果进一步证实，阿帕替尼可诱导肝癌细胞发生显著凋亡。这些体外实验结果表明，阿帕替尼本身对肝癌细胞具有直接的生长抑制和促凋亡作用。

阿帕替尼增强PD-1抑制剂的疗效

为了探究阿帕替尼与PD-1抑制剂的联合效应，研究团队建立了小鼠HCC皮下移植瘤模型。动物实验结果表明，与生理盐水对照组、阿帕替尼单药组或PD-1抑制剂单药组相比，阿帕替尼联合PD-1抑制剂治疗组表现出最显著的肿瘤生长抑制效果，其肿瘤体积最小。在为期30天的生存观察中，联合治疗组的小鼠存活率达到100%，显著优于其他各组。这些发现在Hep 53.4细胞构建的模型中也得到了验证，表明联合治疗的增效作用具有普适性。对剥离的肿瘤实物进行拍照比较，直观地显示了联合治疗组肿瘤体积缩小最为显著。

联合疗法诱导肿瘤坏死并激活STAT1/NK轴

对肿瘤组织进行深入分析发现，联合治疗组肿瘤坏死评分显著高于其他组。通过蛋白质印迹和免疫组化分析证实，阿帕替尼治疗组和联合治疗组中STAT1的表达水平显著上调。同时，免疫组化和免疫荧光染色显示，联合治疗组肿瘤组织中CD8⁺T细胞和NK细胞的浸润数量也显著增加。流式细胞术分析进一步定量证实了联合治疗组肿瘤内NK细胞比例的升高。这些结果提示，阿帕替尼可能通过激活STAT1，进而招募和激活CD8⁺T细胞和NK细胞，从而增强PD-1抑制剂的抗肿瘤免疫反应。

验证STAT1/NK轴介导联合疗法的抗肿瘤功效

为了直接证实STAT1/NK轴的关键作用，研究人员构建了STAT1过表达的Hepa1-6细胞株(STAT1-OE)。在STAT1-OE肿瘤模型中，阿帕替尼与PD-1抑制剂的联合抗肿瘤效果得到进一步增强，肿瘤体积抑制更明显，小鼠生存率更高，并且肿瘤内NK细胞浸润也更多。反之，当使用STAT1抑制剂氟达拉滨或NK细胞清除抗体Asialo GM1处理小鼠时，联合疗法的抗肿瘤效果被显著削弱，表现为肿瘤体积增大、生存率下降、肿瘤坏死减少以及NK细胞浸润降低。这一正一反的实验证据强有力地表明，STAT1/NK轴的激活是阿帕替尼增强PD-1抑制剂疗效的核心机制。

联合疗法重塑肝细胞癌的肿瘤微环境

研究还评估了联合疗法对肿瘤免疫微环境的整体影响。免疫荧光染色结果显示，联合治疗组肿瘤组织中缺氧标志物碳酸酐酶IX(CA IX)的表达显著降低，提示肿瘤缺氧状况得到改善。同时，血管内皮标志物CD31的表达也明显下降，表明肿瘤血管生成受到抑制。此外，肿瘤基质激活标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平在联合治疗组中也显著降低，反映了肿瘤基质活动的减弱。这些变化共同表明，阿帕替尼联合PD-1抑制剂能够重塑肿瘤微环境，使其从免疫抑制状态向有利于抗肿瘤免疫的方向转变。

本研究通过系统的实验证明，阿帕替尼不仅能直接抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡，更重要的是，它能够通过激活STAT1/NK轴，显著增强PD-1抑制剂在晚期肝细胞癌中的抗肿瘤疗效。机制上，阿帕替尼上调STAT1表达，促进细胞毒性CD8⁺T细胞和NK细胞向肿瘤组织浸润，从而与PD-1抑制剂产生协同作用。同时，联合治疗还改善了肿瘤微环境，减轻了缺氧，抑制了血管生成和基质活化。研究结论强调了STAT1/NK通路在介导阿帕替尼与PD-1抑制剂协同抗肿瘤效应中的核心地位。

这项研究的意义在于，它不仅从机制层面深入阐释了临床上已观察到有效的阿帕替尼联合PD-1抑制剂方案的生物学基础，而且为克服肝细胞癌对免疫检查点抑制剂的耐药性提供了新的思路和潜在的靶点。STAT1/NK轴可能成为预测该联合疗法疗效的生物标志物，也为开发新的联合免疫治疗策略提供了理论依据。然而，研究也存在一些局限性，例如未能直接检测STAT1下游靶基因的表达，且实验主要基于单一细胞系模型，未来需要在更多细胞系和临床样本中进行验证。总体而言，该研究深化了对免疫治疗与抗血管生成治疗协同作用机制的理解，对推动肝细胞癌的精准免疫联合治疗具有重要的参考价值。