基于脂肪源干细胞球体与3D打印支架协同策略修复兔桡骨临界骨缺损的研究

《Scientific Reports》：Bone regeneration using adipose derived stem cell spheroids within 3D printed scaffolds in a rabbit radial defect model

本研究针对临界尺寸骨缺损(CSD)修复难题，创新性地将脂肪源干细胞(ADSC)三维球体与聚己内酯/羟基磷灰石(PCL/HA)3D打印支架相结合，通过兔桡骨缺损模型验证该协同策略的成骨效能。体外实验显示ADSC球体显著促进矿化和碱性磷酸酶(ALP)活性；影像学与组织学分析证实实验组新骨体积(NBV)较对照组显著增加，为复杂骨缺损的临床治疗提供了新方案。

　　

骨骼组织虽然具有强大的自我修复能力，但当缺损达到临界尺寸时，这种自愈能力便显得力不从心。临界尺寸骨缺损通常由严重创伤、肿瘤切除或先天性畸形引起，无法通过自然愈合过程修复，必须依靠临床干预。目前，自体骨移植被视为修复此类缺损的"金标准"，但这种方法存在供区并发症、来源有限等固有局限性。虽然同种异体骨、异种骨等替代材料在一定程度上缓解了供体短缺的问题，但由于缺乏骨诱导能力，其成骨效果往往不尽如人意。

在这一背景下，骨组织工程应运而生，为临界尺寸骨缺损的修复带来了新的希望。其中，脂肪源干细胞因其来源广泛、获取便捷、多向分化潜能等优势，成为骨组织工程领域的研究热点。然而，传统的二维单层培养方式难以模拟体内的三维微环境，导致干细胞存活率和功能维持受限。近年来，三维球体培养技术的出现为这一难题提供了解决方案。研究表明，与单层培养的细胞相比，三维球体培养的干细胞能够更好地维持细胞活性，增强成骨分化能力。

与此同时，三维打印技术的快速发展为骨缺损修复提供了新的工具。通过三维打印技术可以制备与缺损区域完美匹配的个性化支架，为骨再生提供结构支持。聚己内酯作为一种生物可降解材料，具有良好的机械性能和可控的降解速率，但其生物活性较差。羟基磷灰石是骨骼的主要无机成分，具有优异的生物相容性和骨传导性，但脆性较大。将两者复合制备的PCL/HA支架，理论上可以兼具良好的机械性能和生物活性。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，韩国全南大学的研究团队创新性地将ADSC球体与3D打印的PCL/HA支架相结合，在兔桡骨临界尺寸缺损模型中系统评估了这一协同策略的成骨效能。研究团队假设，ADSC球体在三维培养环境下能够更好地维持细胞活性和功能，而PCL/HA支架则能为骨再生提供良好的结构支撑，两者的结合有望显著促进骨缺损的修复。

研究团队采用了几项关键技术方法：通过硅胶弹性体凹面微孔板制备ADSC球体；使用气动三维绘图系统制备孔径为500微米的PCL/HA复合支架；利用胶原凝胶作为载体将ADSC单细胞或球体植入支架；建立兔20毫米桡骨临界尺寸缺损模型进行评估；通过微型计算机断层扫描(micro-CT)和组织学分析定量评估新骨形成。

球体形成和细胞活力分析显示，ADSC球体在培养一天后成功形成，活/死染色表明球体培养方式比单细胞培养更能维持细胞活力。到第7天，ADSC单细胞组出现更多死细胞(红色荧光)，而球体组细胞存活率更高。

阿尔辛红S染色分析结果表明，在成骨分化的第7天和第14天，ADSC球体组的钙化面积均显著高于ADSC单细胞组和无细胞组。第14天时，ADSC球体组的染色面积达到100.37±2.10%，显著高于其他组。

碱性磷酸酶活性分析显示，在第14天，ADSC球体组的ALP活性(70.38±0.48 ng/ml)显著高于ADSC单细胞组(43.07±2.54 ng/ml)，表明球体培养方式能更好地促进成骨分化。

影像学分析显示，所有实验组的3D打印支架在植入后8周内均良好保持在缺损区域。微型CT定量分析表明，在第8周，ADSC球体组的新骨体积(145.58±6.48 mm³)显著高于对照组(94.08±6.65 mm³)，表现出更好的成骨效果。

组织学分析显示，在植入后8周，ADSC球体组在缺损边缘和中心均可见明显的新骨形成。Masson三色染色定量分析表明，ADSC球体组的新骨体积百分比(16.33±0.85%)显著高于对照组(9.76±1.41%)。

研究结论和讨论部分强调了这一协同策略的重要意义。传统的二维培养的ADSC单细胞在维持细胞存活和功能方面存在局限性，而三维球体培养通过促进细胞间直接相互作用，更好地模拟体内微环境，从而增强细胞外基质产生和成骨分化能力。本研究首次在兔桡骨临界尺寸缺损模型中系统评估了ADSC球体与3D打印PCL/HA支架的协同作用。

研究结果显示，ADSC球体在体外表现出更强的矿化能力和ALP活性，在体内促进更多新骨形成。这种成骨优势可能归因于球体结构增强的细胞间相互作用、旁分泌信号传导以及对抗缺氧压力的能力。特别是在缺损中心区域观察到的新骨形成，表明ADSC球体可能通过促进血管生成改善了缺损区域的血液供应。

与先前研究相比，本研究采用的兔桡骨缺损模型更能模拟临床环境中负重骨的修复情况。研究团队使用胶原凝胶作为球体载体，解决了球体在支架中均匀分布的技术难题，这一方法创新为后续研究提供了重要参考。

然而，研究也发现了一些局限性。在8周的实验期间，PCL/HA支架几乎没有降解迹象，这可能影响长期的骨重塑过程。此外，研究缺乏对支架材料特性的系统表征，如机械性能、降解动力学等。未来的研究需要优化球体递送方法，延长观察时间，并纳入分子水平分析以阐明其作用机制。

尽管存在这些限制，本研究为复杂临界尺寸骨缺损的治疗提供了有前景的策略。通过将ADSC球体与个性化3D打印支架相结合，不仅解决了结构支撑问题，还增强了生物活性，为骨组织工程领域的发展指明了新方向。随着后续研究的深入，这一策略有望在临床实践中发挥重要作用，为众多骨缺损患者带来福音。