靶向PSA与DPP-IV的红色荧光探针实现结直肠癌肺转移灶的快速精准成像

《Scientific Reports》：Rapid imaging of pulmonary metastasis from colorectal cancer with a red fluorescence probe targeting puromycin-sensitive aminopeptidase and dipeptidyl peptidase IV

本研究针对结直肠癌肺转移术中难以快速界定切缘的临床难题，开发了一种靶向嘌呤霉素敏感性氨肽酶（PSA）和二肽基肽酶IV（DPP-IV）的红色荧光探针QA-2OMeSiR。研究通过筛选肽基-HMRG探针库，发现该探针可在10分钟内高对比度显影转移灶，对直肠癌和结肠癌肺转移的检测灵敏度分别达83.3%和100%，特异性达91.7%和88.9%。该技术为肺转移瘤切除术中实时评估切缘提供了新工具，有望降低术后局部复发风险。

　　

在肿瘤治疗领域，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）肺转移的切除手术始终面临一个关键挑战：如何在最大限度保留健康肺组织的同时，确保肿瘤被完整切除，防止局部复发。尤其是亚肺叶切除等保肺手术，对手术切缘的精准判断要求极高。传统术中病理检查虽准，但耗时长、成本高，且难以对切缘进行全面评估。有没有一种方法，能让肿瘤在手术中“自发发光”，为外科医生提供实时的导航？

针对这一临床需求，日本东京大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新研究，他们开发出一种名为QA-2OMeSiR的红色荧光探针。该探针能像“智能开关”一样，在遇到肿瘤组织中高表达的两种酶——嘌呤霉素敏感性氨肽酶（Puromycin-Sensitive Aminopeptidase, PSA）和二肽基肽酶IV（Dipeptidyl Peptidase-IV, DPP-IV）时，迅速被激活发出强烈荧光，从而在10分钟内清晰勾勒出肺转移灶的边界。

研究的起点是对一个包含381种探针的肽基-HMRG（Hydroxymethyl Rhodamine Green）文库进行筛选。研究人员使用直肠癌肺转移组织的裂解液进行测试，寻找在肿瘤组织中反应活性高、且在肿瘤与正常组织间信噪比（T/N）突出的探针。KK-HMRG等探针表现出色，而此前研究已表明KK-HMRG在原发性肺癌中能被PSA激活。抑制剂实验证实，PSA抑制剂嘌呤霉素能显著抑制KK-HMRG在转移灶裂解液中的荧光激活，这提示PSA同样是结直肠癌肺转移中的一个关键生物标志物酶。

基于此，研究团队将目光投向其先前为原发性肺癌开发的升级版探针QA-2OMeSiR。该探针采用2-甲基硅罗丹明（2OMeSiR）荧光团，其荧光通过受体激发光诱导电子转移（acceptor-excited Photoinduced Electron Transfer, a-PeT）和吸收波长位移效应而被高效淬灭。当PSA或DPP-IV切割其底物二肽（谷氨酰胺-丙氨酸，QA）后，探针解淬灭，释放出强烈的红色荧光。与绿色荧光的HMRG探针相比，红色荧光的QA-2OMeSiR能更有效地避免组织自发荧光的干扰。

关键技术方法概述

本研究的关键技术包括：1）利用包含381种探针的肽基-HMRG文库对来自21例结直肠癌肺转移患者的术后组织裂解液进行高通量筛选；2）使用Maestro活体成像系统对新鲜或冻存的肿瘤/正常组织块进行QA-2OMeSiR（50 μM）的离体荧光成像，量化时间依赖的荧光增强；3）采用PSA抑制剂嘌呤霉素和DPP-IV抑制剂西格列汀进行酶活性抑制实验；4）通过免疫组织化学（IHC）染色验证PSA和DPP-IV在组织中的蛋白表达水平。

Results

Screening of our fluorescence probe library with human surgical specimens of pulmonary metastasis from rectal cancer

通过对4例直肠癌肺转移组织裂解液的筛选，研究人员确定了12个候选探针（平均CVR_{60 min-0 min}> 0.02且平均T/N > 2.0）。其中，KK-HMRG表现出高且稳定的活性。抑制剂实验证实，PSA是其在转移灶中的主要靶点，这为后续使用靶向PSA的QA-2OMeSiR提供了理论依据。

Imaging-based evaluation of QA-2OMeSiR in human surgical specimens of pulmonary metastasis from colorectal cancer

在12例直肠癌和9例结肠癌肺转移的离体组织验证中，QA-2OMeSiR表现出卓越性能。在应用探针10分钟后，其对直肠癌肺转移检测的灵敏度为83.3%，特异性为91.7%（AUC = 0.875）；对结肠癌肺转移的灵敏度高达100%，特异性为88.9%（AUC = 0.951）。对照实验证实，荧光差异源于酶活性，而非组织本身的光学特性。

Fluorescence increase of QA-2OMeSiR in pulmonary metastasis from colorectal cancer in the presence and absence of inhibitors of target enzymes

抑制剂实验揭示了QA-2OMeSiR的激活机制。在结肠癌转移灶中，嘌呤霉素（PSA抑制剂）和西格列汀（DPP-IV抑制剂）均能抑制荧光增强，其中PSA的贡献占主导地位。在直肠癌转移灶的组织块实验中，抑制剂效果不明显，但在其组织裂解液中，PSA的抑制作用再次凸显，推测可能与抑制剂在完整组织中的渗透差异有关。这表明PSA是主要靶点，DPP-IV也参与其中，但贡献度因个体差异而略有不同。

Immunohistochemical analysis of PSA and DPP-IV in pulmonary metastases from colorectal cancer

免疫组化结果从蛋白表达层面提供了支持：与正常肺组织相比，结直肠癌肺转移灶中的PSA和DPP-IV表达水平均显著上调。这首次将PSA和DPP-IV确立为结直肠癌肺转移的潜在生物标志物。

Application of QA-2OMeSiR for the specific demarcation of rapid visualization of pulmonary metastasis from colorectal cancer

最终，在包含肿瘤和正常组织边界的较大手术标本上进行测试，QA-2OMeSiR在10-20分钟内即在肿瘤区域产生特异性荧光，其范围与术后HE染色确定的癌区高度吻合，而低荧光区域对应正常组织。免疫组化再次证实，荧光强区正是PSA和DPP-IV高表达区。

讨论与结论

本研究成功地将QA-2OMeSiR确立为第一个用于人结直肠癌肺转移检测的高灵敏度可激活荧光探针。其核心优势在于“快速”和“高对比度”。10分钟的显影时间完全符合术中实时导航的需求，而高的灵敏度与特异性使其在评估手术切缘方面极具潜力，尤其有助于发现肉眼难以辨识的微小残留病灶，从而可能降低楔形切除等保肺手术后的局部复发率。

研究同时确立了PSA和DPP-IV作为结直肠癌肺转移的新生物标志物酶。虽然PSA是主要贡献者，但双靶点设计可能赋予了探针更广的适用性和稳健性。值得注意的是，在少数含有乳头状成分的直肠癌转移灶中，探针激活效果不佳，提示肿瘤异质性可能影响检测效率，未来需要在更大队列中验证其普适性。

总之，QA-2OMeSiR为结直肠癌肺转移瘤切除术提供了一种极具前景的术中导航工具。相较于传统的“常亮”型探针或耗时的术中病理，这种基于特定酶活性的可激活探针策略，为实现快速、精准、全切缘评估的癌症手术开辟了新途径。未来的研究将聚焦于该探针的活体应用可行性验证及其临床转化。