响应面法优化非生物诱导子提升鸡冠花细胞悬浮培养中甜菜红素产量与抗氧化活性

《Scientific Reports》：Response surface optimization of abiotic elicitors for betalain production and antioxidant capacity in Celosia argentea cell suspension cultures

本研究针对鸡冠花(Celosia argentea)细胞悬浮培养中甜菜红素产量低的问题，通过响应面法(RSM)优化了6-苄氨基嘌呤(BAP)、茉莉酸甲酯(MeJA)和硫酸铜(CuSO4)三种非生物诱导子的组合条件。研究发现最佳配方(2.28μM BAP、49.97μM MeJA、6.71μM CuSO4)使甜菜红素产量提高3.9倍，达到139.99 mg/L(7.54 mg/g DW)，且提取物抗氧化活性显著增强。该研究为食品、医药和化妆品行业提供了高效生产天然色素的新策略。

　　

在追求天然健康产品的今天，合成色素因其潜在健康风险逐渐被市场淘汰，而天然色素的需求持续增长。甜菜红素(Betalains)作为一类水溶性天然色素，不仅呈现鲜艳的红色-紫色和黄色-橙色，还具有抗氧化、抗癌、抗菌和抗炎等多种生物活性，在食品、医药和化妆品行业展现出广阔应用前景。然而，从植物中直接提取甜菜红素面临诸多挑战：生产成本高、受季节和地理条件限制、可能污染风险以及产量不稳定等。

传统甜菜红素生产主要依赖红甜菜(Beta vulgaris)，但科学家们一直在寻找更优质的来源。鸡冠花(Celosia argentea var. plumosa)作为苋科(Amaranthaceae)植物，是甜菜红素的天然生产者，但其天然产量有限，难以满足工业化需求。植物细胞悬浮培养技术为这一难题提供了解决方案，它可以在受控环境中全年稳定生产天然产物，不受外界环境因素影响。

尽管植物细胞培养技术前景广阔，但实现甜菜红素的高效生产仍面临重大挑战。现有研究多采用单因素优化方法，无法充分揭示各因素间的相互作用，导致生产效率低下。特别是对于鸡冠花这种有潜力的甜菜红素来源，如何通过系统优化培养条件最大化产量，同时提升产物的生物活性，成为该领域亟待解决的关键科学问题。

针对这一挑战，泰国孔敬大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了创新性研究，他们采用响应面法(Response Surface Methodology， RSM)这一先进的统计工具，系统优化了鸡冠花细胞悬浮培养中甜菜红素的生物合成条件。研究团队聚焦三种关键非生物诱导子：6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine， BAP)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate， MeJA)和硫酸铜(copper sulfate， CuSO₄)，通过中心复合设计(Central Composite Design， CCD)建立了精确的数学模型，成功将甜菜红素产量提升近4倍，并显著增强了提取物的抗氧化能力。

研究团队运用了多项关键技术方法：建立了稳定的鸡冠花细胞悬浮培养体系，通过细胞生长曲线确定了指数生长期；采用响应面法中的中心复合设计优化三种诱导子浓度；通过ABTS、DPPH和FRAP三种方法系统评估了提取物的抗氧化活性；使用显微镜观察细胞形态变化，确保培养体系健康稳定。

细胞悬浮培养及生长模式确定

研究首先建立了鸡冠花细胞悬浮培养体系的基础参数。在标准培养条件下(含3%蔗糖、1 mg/L 2，4-D和0.1 mg/L BAP)，细胞干重和甜菜红素含量在第15天达到峰值，分别为19.90 g/L和35.61 mg/L(1.95 mg/g DW)。细胞形态学观察显示，培养细胞呈椭圆形和球形，细胞内含有红色色素，表明甜菜红素成功在液泡中积累。这种红色色素在细胞干燥后呈现深红紫色，水提取后获得红色提取物，证实了甜菜红素的稳定存在。

采用统计实验设计优化培养条件以增强甜菜红素色素生产

研究团队采用响应面法系统优化了三种诱导子的浓度配比。通过中心复合设计，确定了BAP(1.33-3.11μM)、MeJA(48.00-52.00μM)和CuSO₄(4.40-8.40μM)的最佳浓度范围。建立的二次多项式回归模型具有高度显著性(p < 0.0001)，确定系数(R2)达到0.9878，表明模型能够准确预测甜菜红素产量。方差分析显示，BAP的线性项、BAP与MeJA的交互项以及各因素的二次项对甜菜红素生产均有显著影响。

三维响应面图和等高线图直观展示了各因素间的相互作用。结果表明，适当浓度的BAP、MeJA和CuSO₄均能促进甜菜红素生产，但超过最佳浓度后会产生抑制效应。这一发现强调了精确控制诱导子浓度的重要性，也为工业化生产提供了精确的工艺参数。

优化条件下的生长模式和甜菜红素生产评估

验证实验表明，最优培养条件(2.28μM BAP、49.97μM MeJA、6.71μM CuSO₄，在第9天指数生长期添加)使甜菜红素产量达到139.99 mg/L(7.54 mg/g DW)，细胞干重为16.90 g/L。与优化前相比，甜菜红素产量提高了3.93倍，且细胞呈现更深的红色色素积累，表明优化条件有效激活了甜菜红素生物合成途径。

甜菜红素提取物抗氧化能力的测定

研究团队通过ABTS、DPPH和FRAP三种方法系统评估了优化培养条件下甜菜红素提取物的抗氧化能力。结果显示，优化培养条件下的提取物在DPPH自由基清除实验中表现出98.14%的清除率，甚至超过了维生素C对照组(93.32%)。FRAP实验表明，优化培养提取物的铁离子还原能力达到2036 μmol Fe²⁺/g DW，分别是未优化培养物和花提取物的2.6倍和3.8倍。

这一发现具有重要意义，它不仅证实了甜菜红素的强抗氧化活性，更表明通过优化培养条件可以同步提升色素产量和生物活性，为开发具有功能性的天然色素产品奠定了坚实基础。

该研究通过响应面法成功建立了鸡冠花细胞悬浮培养的优化体系，实现了甜菜红素产量的显著提升和抗氧化活性的同步增强。研究证实BAP、MeJA和CuSO₄的组合使用具有协同效应，能有效激活甜菜红素生物合成途径。特别值得注意的是，优化条件下生产的甜菜红素提取物表现出卓越的抗氧化性能，在DPPH自由基清除方面甚至优于维生素C，这为天然抗氧化剂的开发提供了新来源。

从技术层面看，本研究突破了传统单因素优化方法的局限，通过系统性的多因素优化策略，为植物次级代谢产物的高效生产提供了新思路。建立的数学模型具有高度预测准确性，为工业化放大生产提供了理论依据。从应用角度，该技术不仅适用于甜菜红素生产，也可为其他高价值植物次级代谢产物的生物制造提供参考。研究展现的细胞培养技术优势——包括全年生产、质量稳定、不受地理气候影响等，使其成为传统种植提取法的有竞争力替代方案。

然而，研究也存在一定局限性，如仅在实验室规模进行验证，工业化放大效果有待确认；仅关注三种诱导子，其他潜在影响因素未充分探索；对甜菜红素组成分析不够深入等。未来研究可聚焦于反应器放大工艺优化、生物合成途径基因表达调控机制解析以及不同甜菜红素组分的功能特性差异等方面，进一步推动该技术向产业化应用发展。

总体而言，这项研究为天然色素的可控生产提供了创新性解决方案，在食品安全、健康产业和可持续发展方面具有重要价值。通过细胞培养技术生产高价值天然产物的策略，不仅满足市场对安全、健康产品的需求，也符合绿色生物制造的发展方向，展现出广阔的应用前景。