METTL3通过m6A RNA甲基化与表观遗传调控守护人类滋养层干细胞命运及胎盘发育

《Nature Communications》：METTL3 safeguards cell identity and epigenome of human trophoblast stem cells

本研究聚焦胎盘发育关键细胞——滋养层干细胞（hTSC）的身份维持机制。研究人员发现RNA m6A甲基转移酶METTL3通过直接调控组蛋白修饰因子（EP300/EZH2）的mRNA稳定性，维持表观遗传稳态（H3K27ac/H3K27me3平衡），从而阻止hTSC过早衰老和炎症激活。该机制在子痫前期（PE）患者胎盘中异常，靶向抑制EP300可逆转疾病表型，为妊娠相关疾病提供了新靶点。

　　

生命的起始总是充满奇迹，而胎盘作为连接母体与胎儿的神秘桥梁，更是这场生命交响曲中不可或缺的指挥家。它由滋养层细胞构成，这些细胞的正常增殖、分化和功能维持是成功妊娠的基石。然而，当滋养层细胞，特别是其“干细胞”——细胞滋养层细胞（CTBs）的功能出现紊乱时，一系列妊娠相关疾病，如子痫前期（PE），便会悄然而至，严重威胁母婴健康。科学家们一直试图揭示调控滋养层细胞命运的深层机制。近年来，RNA修饰，尤其是最普遍的N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰，在调控基因表达和细胞命运决定中展现出关键作用，但其在人类胎盘发育，特别是在滋养层干细胞中的具体功能和机制，仍是一片待探索的广阔领域。

为了回答这些问题，由香港大学、南开大学等机构的研究人员领衔的团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新发现。他们利用人类扩展潜能干细胞（hEPSCs）和滋养层干细胞（hTSCs）等体外模型，结合临床胎盘样本分析，深入探究了核心m⁶A甲基转移酶METTL3在人类滋养层谱系发育中的关键作用及其与子痫前期的潜在关联。

研究人员运用了多种关键技术方法，包括利用可诱导基因敲除（iKO）系统在hEPSCs和hTSCs中条件性敲除METTL3、甲基化RNA免疫共沉淀测序（MeRIP-seq）分析m⁶A修饰谱、RNA测序（RNA-seq）分析转录组变化、切割标签技术（CUT&Tag）分析组蛋白修饰（H3K27ac, H3K27me3）和转录因子结合、RNA稳定性测定、以及对人早期妊娠、足月妊娠和子痫前期胎盘组织进行免疫荧光染色分析等。

METTL3特异性标记人胎盘中的细胞滋养层细胞

通过对已发表的人胎盘单核RNA测序（snRNA-seq）数据的再分析，研究人员发现METTL3及其复合物伙伴METTL14的特异性高表达局限于细胞滋养层细胞（CTBs）和增殖相关CTBs（pCTBs）。当CTBs向合体化能力阶段过渡时，METTL3和METTL14的表达显著下降。相反，m⁶A去甲基化酶FTO和ALKBH5的表达在合体滋养层（STBs）成熟过程中增加。免疫荧光染色证实，在孕8周和足月人胎盘绒毛中，METTL3和METTL14蛋白确实特异性地表达于PEG10阳性的CTBs中，而不表达于分泌hCG的STBs。这些结果提示METTL3可能对维持CTBs的细胞特性和分化能力至关重要。

METTL3和m⁶A甲基化在hTSCs向STBs分化过程中下调

与体内观察一致，在hTSCs体外分化成STBs的过程中，METTL3和METTL14的蛋白和mRNA表达水平均下降，整体m⁶A水平也显著降低。MeRIP-seq分析进一步揭示，与hTSCs相比，分化第6天的STBs中m⁶A修饰峰数量减少，且这些峰主要位于转录本的3‘非翻译区（3’UTR）。例如，hTSCs的标志基因PEG3、PEG10和MKI67在hTSCs中有m⁶A修饰，但在STBs中修饰水平大幅下降。而一些STBs标志基因（如CGA, CGBs）的转录本在两种细胞中均未检测到m⁶A修饰。这表明m⁶A甲基化通路在hTSCs向STBs分化过程中整体下调，但其模式具有基因特异性。

METTL3是hEPSCs生成hTSCs所必需的

为了研究METTL3在滋养层谱系发育中的作用，研究人员在METTL3敲除（KO）的hEPSCs中建立了多西环素（DOX）诱导的METTL3表达系统（iKO）。结果发现，在没有DOX（即METTL3缺失）的情况下，hEPSCs无法有效分化为滋养层细胞，表现为滋养层主调控因子GATA2和GATA3表达降低，而多能性标志物NANOG持续表达，成熟滋养层激素hCG分泌显著减少。这表明METTL3对于从hEPSCs成功产生hTSCs至关重要，其缺失可能导致多能性退出失败，从而阻碍滋养层分化。

METTL3缺失导致hTSCs功能缺陷

在已建立的hTSCs中，METTL3表达水平很高。当撤除DOX导致METTL3蛋白水平急剧下降后，hTSCs出现严重的增殖缺陷，细胞变得扁平、增大、多核化，呈现类似STB分化的融合趋势。透射电镜显示METTL3缺失的hTSCs出现细胞死亡相关特征（如凋亡小体、肿胀线粒体）和溶酶体数量增加。同时，细胞死亡相关蛋白（RIPK1, RIPK3, MLKL）被激活，DNA损伤标志物（γH2AX, 53BP1）和衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增强。转录组分析显示，METTL3缺失导致与激素活性、炎症反应、衰老相关分泌表型（SASP）、TNFα/NF-κB信号通路以及STB基因特征相关的通路显著富集。使用METTL3特异性抑制剂STM2457处理多种野生型hTSC细胞系，也重现了METTL3基因敲除的表型。然而，尽管METTL3缺失的hTSCs表达了更多成熟滋养层（尤其是STB）标志基因，但这些基因的表达水平仍远低于正常分化的STBs，且由其分化而来的STBs不能有效表达hCG等关键功能蛋白，表明这是一种早熟的分化，而非真正的STB发育。这些结果综合表明METTL3对于维持hTSCs的自我更新、细胞存活、身份认同和正常分化潜能不可或缺。

METTL3通过m⁶A依赖和非依赖机制调控hTSCs基因表达

MeRIP-seq分析发现，METTL3缺失导致hTSCs中6077个基因的m⁶A甲基化水平降低，这些峰富集在3‘UTR区域和经典的“GGACU” motif。功能富集分析显示受影响基因涉及蛋白质和组蛋白修饰、子宫胚胎和胎盘发育、DNA复制和修复等通路。然而，整合RNA-seq和MeRIP-seq数据发现，在METTL3缺失后上调的STB、SASP和炎症反应相关基因集中，只有10-20%的转录本带有m⁶A修饰，且这些m⁶A修饰转录本的表达变化幅度与非修饰转录本相似甚至更小。例如，STB标志基因ERVW-1和CGA并无m⁶A修饰却显著上调。这表明METTL3通过m⁶A依赖和非依赖两种方式调控基因表达，且后者可能占主导地位。

METTL3通过表观转录组和组蛋白表观遗传机制协调滋养层基因网络

RNA稳定性分析表明，METTL3缺失后，hTSCs中的转录本整体上更稳定。通过交叉分析m⁶A修饰、表达上调和半衰期延长的基因，研究人员鉴定出168个可能受m⁶A直接通过RNA衰变调控的基因，其中包括组蛋白乙酰转移酶EP300和转录因子JUND、FOSL2、CEBPA。相反，组蛋白甲基转移酶EZH2（催化H3K27me3）的转录本则表现为m⁶A修饰、表达下调和稳定性降低。蛋白水平验证证实，METTL3缺失导致EP300、c-JUN、JUND蛋白和H3K27ac水平升高，而EZH2蛋白和H3K27me3水平降低。CUT&Tag分析进一步显示，在METTL3缺失的hTSCs中，全基因组水平的H3K27ac显著升高，H3K27me3降低，且EP300和JUND的结合位点增多。对STB、SASP和炎症基因集的分析发现，H3K27ac、EP300和JUND的富集显著增加，而H3K27me3富集减少。许多上调的基因即使本身没有m⁶A修饰，也表现出这种表观遗传状态的改变，表明METTL3通过调控关键表观遗传调节因子，间接地重塑了染色质景观，从而影响基因表达。

通过化学调控组蛋白修饰可有效挽救METTL3-KO hTSCs缺陷

鉴于表观遗传失调在表型中的重要作用，研究人员尝试用化学方法纠正H3K27ac和H3K27me3水平。使用EP300抑制剂A-485处理METTL3缺失的hTSCs，可降低H3K27ac水平，并有效抑制异常表达的STB蛋白（如hCG, SDC1）。使用KDM6B抑制剂GSK-J1提高H3K27me3水平，也能部分抑制STB标志蛋白的表达。这些结果表明，通过药物干预纠正失调的组蛋白修饰，可以缓解METTL3缺失引起的基因表达缺陷。

METTL3-KO hTSCs呈现子痫前期分子特征且抑制EP300可缓解此特征

由于胎盘滋养层过早衰老和CTBs缺陷与子痫前期（PE）相关，且已有研究报道严重子痫前期（sPE）患者CTBs中存在H3K27ac水平普遍升高，研究人员推测METTL3缺失的hTSCs可能呈现PE样特征。分析发现，sPE患者CTBs中高表达的基因，在METTL3缺失的hTSCs中也显著上调。同时，与PE相关的转座子LTR10A在METTL3缺失的hTSCs中表现出增强子活性、染色质可及性增加、H3K27ac水平和JUND结合升高。使用A-485抑制EP300，能有效减轻这种PE特征基因的表达。此外，利用CRISPR/Cas9技术特异性敲除hTSCs中的LTR10A位点，可降低其附近PE相关基因（如ENG, ATG9B）的表达。这提示METTL3缺失通过表观遗传改变激活特定遗传元件，可能参与了PE的发病机制。

METTL3-EP300-H3K27ac轴是滋养层发育的关键调控因子并参与子痫前期发病

对体内人胎盘组织的分析显示，表达METTL3的CTBs其H3K27ac水平显著低于不表达METTL3的滋养层细胞，而H3K27me3水平与METTL3表达无显著相关性。更重要的是，在对子痫前期患者足月胎盘的分析中发现，与正常胎盘相比，PE胎盘CTBs（PEG10阳性细胞）中METTL3阳性细胞比例显著减少，且残留的CTBs中METTL3表达水平也明显降低。同时，PE CTBs中的H3K27ac水平则显著高于正常对照。这直接将METTL3表达缺失与PE病理中的表观遗传失调（H3K27ac异常升高）联系起来。

综上所述，本研究首次系统性地揭示了METTL3介导的m⁶A RNA甲基化在人类滋养层干细胞命运决定中的核心作用。METTL3不仅对hTSCs的生成至关重要，更是其身份维持者。它通过直接调控组蛋白修饰因子（如EP300, EZH2）和关键转录因子（如JUND）的mRNA稳定性，维持了hTSCs正常的表观遗传稳态（H3K27ac/H3K27me3平衡），从而防止细胞过早衰老、炎症激活和异常分化。METTL3的缺失会破坏这种平衡，导致hTSCs获得子痫前期相关的转录组特征。在子痫前期患者胎盘中观察到的METTL3下调和H3K27ac上调进一步支持了该机制在疾病发生中的潜在重要性。这项研究不仅深化了我们对RNA修饰在胎盘发育中作用的理解，也为子痫前期等妊娠相关疾病的机制研究和潜在治疗策略（如靶向EP300）提供了新的视角和实验依据。未来的研究可进一步探索利用METTL3激活剂或相关通路调节剂干预妊娠相关疾病的可行性。