扩展遗传字母提升六字母DNA结构化学多样性，实现靶向蛋白的高亲和力适配体

《Nature Communications》：Expanded genetic alphabet increases structural and chemical diversity of six-letter DNA for high-affinity protein-targeting aptamers

本研究针对传统DNA适配体亲和力与特异性不足的瓶颈，通过引入Ds-Px/Pa'人工碱基对开发六字母DNA系统。冷冻电镜结构解析揭示，疏水碱基Ds通过独特堆叠作用稳定适配体三级结构，而Pa'的丙炔基直接嵌入NS1蛋白疏水口袋，使XenoAptamers对登革热NS1蛋白变体实现pM级亲和力与单氨基酸水平特异性，为核酸药物开发提供新范式。

　　

在生命科学领域，DNA适配体因其可化学合成、低免疫原性等优势，被视为抗体的潜在替代品。然而，由四种天然碱基组成的DNA分子存在化学多样性有限、难以结合蛋白疏水表面等先天不足，导致传统适配体亲和力多在纳摩尔水平，制约其临床应用。如何突破天然核酸的局限性，成为领域内亟待解决的关键问题。

日本东京大学与Xenolis公司的联合团队在《Nature Communications》发表突破性研究，通过扩展遗传字母引入Ds-Px/Pa'人工碱基对，成功开发出能特异性识别登革热病毒NS1蛋白变体的六字母DNA适配体（XenoAptamers）。该研究不仅证实人工碱基可将适配体亲和力提升至皮摩尔级别，更通过冷冻电镜结构解析首次揭示人工碱基通过"剑盾协同"机制增强结合能力的分子基础。

研究主要采用冷冻电镜单颗粒分析技术解析复合物结构，通过电泳迁移率变动实验和表面等离子共振技术验证结合特性，并利用化学合成法制备含人工碱基的DNA序列。实验中使用的登革热NS1蛋白通过Expi293F细胞表达系统获得。

Distinct tertiary structures of XenoAptamers for precise target protein discrimination

冷冻电镜结构显示，AptD1、AptD1c和AptD2-Pa'分别与不同血清型NS1蛋白结合时，均形成独特而稳定的三级结构。这些适配体通过精确的形状互补性识别NS1蛋白表面带正电荷区域，结合界面面积达806-1055 ?2。尤为重要的是，所有XenoAptamers均能与NS1二聚体、四聚体和六聚体结合而不破坏寡聚体结构，表明其具有精准识别复杂蛋白界面的能力。

The fifth letter, Ds, enhances the structural diversity of DNA aptamer by facilitating unique, stable base-stacking formations

结构分析表明，Ds碱基通过其独特的芳香环系统与周围天然碱基形成广泛堆叠，构建稳定的疏水核心。在AptD1中，Ds19与T18、T21堆叠；在AptD2中，Ds23与G-四链体表面堆叠。研究表明，通过将Ds替换为偶极矩更匹配的Ys或Bs变体（如AptD1-YsBs），可进一步稳定堆叠结构，使结合亲和力提升5倍以上。这种通过调控偶极矩优化堆叠作用的策略，为适配体后期优化提供了新思路。

The sixth letter, Px/Pa', directly interacts with a hydrophobic pocket in the target protein

研究首次发现Pa'碱基的丙炔基可深入NS1蛋白疏水口袋。在AptD2与DENV2-NS1复合物中，Pa'35的丙炔基插入由Ile96、Leu247等残基形成的疏水口袋，而将Pa'替换为胸腺嘧啶或丙炔基尿苷均导致结合能力显著下降。这种"丙炔基-蛋白疏水口袋"的相互作用模式此前未见报道，拓展了核酸-蛋白相互作用的认知边界。

Precise interactions between XenoAptamer and serotype- or variant-specific DENV-NS1 proteins

结构分析揭示了XenoAptamers实现单氨基酸水平特异性的分子机制。AptD1通过Lys227等变体特异性残基区分DENV1-NS1的两种变体；AptD2则通过识别His261等DENV2-NS1特有残基实现血清型特异性。特别值得注意的是，仅需2个氨基酸差异（Val178/Met178和Lys227/Arg227）即可被XenoAptamers精准区分，展现出超常识别精度。

该研究通过结构生物学手段首次阐明人工碱基增强DNA适配体功能的双重机制：Ds碱基作为"盾"稳定适配体独特构象，Pa'碱基作为"剑"直接参与靶标识别。这种"剑盾协同"作用使六字母DNA同时拓展了核酸的结构多样性与化学多样性。研究成果不仅为高特异性诊断试剂的开发奠定基础，更展示了遗传字母扩展技术在核酸药物领域的巨大潜力。通过将人工碱基对与其他核酸修饰技术结合，有望创建具有更丰富功能的核酸分子，推动核酸药物进入全新发展阶段。