CysLT2R的激动-变构双重调节机制的结构解析：为炎症性疾病药物研发提供新视角

《Nature Communications》：Molecular insights into ago-allosteric modulation at cysteinyl leukotriene receptor 2

本研究针对半胱氨酰白三烯受体CysLT2R的激活机制不明问题，通过冷冻电镜技术解析了LTC4/LTD4-CysLT2R-Gq复合物结构，发现CysLTs通过结合ICL2区域变构位点发挥ago-PAM作用，揭示了非经典激活路径，为靶向CysLT2R的变构药物设计奠定结构基础。

　　

在炎症反应和多种疾病的发生发展中，半胱氨酰白三烯（CysLTs）作为重要的脂质介质，通过与其特异性受体结合发挥关键作用。其中，CysLT₂R（半胱氨酰白三烯受体2）不仅参与哮喘、过敏性鼻炎等炎症性疾病，近年来还被发现与心血管疾病、神经退行性疾病甚至肿瘤进展密切相关。尽管CysLT₁R的选择性拮抗剂（如孟鲁司特）已成功应用于临床，但针对CysLT₂R的药物研发却屡屡受挫，一个重要原因在于对其内源性配体识别和受体激活机制的结构基础缺乏清晰认识。

传统观点认为，CysLTs（包括LTC₄、LTD₄和LTE₄）与它们的受体结合于正构结合口袋。然而，这种理解正面临着挑战。最近的研究发现，神经酰胺也能激活CysLT₂R，并且其结合位点与已知的拮抗剂位点重叠，这提示CysLT₂R的激活机制可能更为复杂。此外，尽管已有CysLT₂R与拮抗剂的晶体结构报道，但激动剂结合状态下的受体结构一直缺失，严重阻碍了人们对CysLT₂R完全激活机制的理解，也限制了靶向该受体的高效、选择性药物的开发。

为了解决这一难题，广州医科大学附属中医医院、中国科学院深圳先进技术研究院等机构的研究人员李牧、包晓玲、陈万彪等人合作，在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。该研究成功解析了人源CysLT₂R与内源性激动剂LTC₄和LTD₄结合并偶联G_q蛋白的冷冻电镜（cryo-EM）结构，分辨率分别达到3.3 ?和3.5 ?。令人惊讶的是，结构分析表明CysLTs并非结合于传统的正构口袋，而是结合在由跨膜区（TM）3、4、5和细胞内第二环（ICL2）形成的、朝向细胞膜脂质层的变构口袋中。这一发现从根本上改变了人们对CysLTs信号传导的认知。

关键技术方法

本研究主要运用了以下关键技术：利用杆状病毒-昆虫细胞（Sf9）系统共表达人源CysLT₂R、工程化迷你G_q蛋白（mini-G_αq）、G_β1γ2亚基和单链抗体scFv16；采用NanoBiT tethering策略和抗FLAG亲和层析结合分子排阻色谱（SEC）纯化蛋白复合物；通过冷冻电镜单颗粒分析技术解析高分辨率三维结构；利用基于NanoBiT的G蛋白招募实验和细胞表面表达检测（FACS）进行突变体的功能验证。

CysLTs是CysLT₂R的激动-变构调节剂（ago-PAM）

功能实验证实，CysLTs（以LTC₄为例）不仅自身是高效激动剂（EC₅₀= 3.9 nM），还能显著增强另一内源性激动剂C16:0神经酰胺的效价（EC₅₀）和最大效应（E_max）。这表明CysLTs对CysLT₂R具有典型的正变构调节（PAM）作用，因此被定义为激动-变构调节剂（ago-PAM）。受体完全激活需要CysLTs（结合变构位点）和神经酰胺（结合正构位点）的协同作用。

CysLTs被CysLT₂R识别的分子机制

结构显示，LTC₄和LTD₄的变构结合口袋高度重叠。其甘氨酸头部的带负电羧基与受体上的H142^3.56以及由R145^ICL2稳定的极性相互作用网络至关重要。点突变实验表明，破坏此相互作用网络（如H142A, R145A）会显著削弱配体效力。结合口袋的疏水环境由TM3、TM4、TM5和ICL2上的多个疏水氨基酸残基构成。

CysLT_{2从失活态到激活态的构象变化}

与神经酰胺激活或拮抗剂结合的非活性结构相比，LTC₄结合的CysLT₂R其胞外区结构更接近于非活性状态，而胞内区则呈现出典型的激活构象，特别是TM6发生了显著的外移。这表明CysLTs通过变构位点引发的激活信号，主要从受体的胞内侧开始传导，而不依赖于胞外区的构象重排，这是一种非经典的激活路径。

CysLTs激活CysLT₂R的机制

激活路径的关键事件包括：1. LTC₄与H142^3.56的相互作用引起ICL2的构象变化，使其向上移动，进而使F144^ICL2能够插入G_αq的疏水腔中，稳定受体-G蛋白复合物。2. LTC₄的胱氨酰部分迫使TM5向TM6移动，导致Y221^5.58侧链旋转，与TM6发生空间碰撞，进而推动TM6外移。Y221A突变完全废除受体活性，而Y221F能部分恢复功能，证实了该残基的重要性。3. TM7上的NPxxY基序（Y305^7.53）向TM束中心穿透，这是A类GPCR激活的共同特征。

CysLT₂R与G_q偶联的共同与独特结构特征

尽管激活方式不同，LTC₄和神经酰胺激活的CysLT₂R与G_q蛋白的偶联界面在整体上相似。G_αq的C末端α5螺旋插入受体胞质腔，与受体残基形成广泛的极性和疏水相互作用。ICL2在耦合中扮演重要角色，其构象变化后与G_αq形成特异性相互作用，进一步稳定了复合物。

研究结论与意义

该研究突破了传统认知，首次揭示了CysLTs作为ago-PAM，通过结合于CysLT₂R的变构“ICL2位点”激活受体。研究阐明了一条不依赖于胞外正构口袋构象变化的非经典激活路径。这一发现对基于结构的药物设计（SBDD）具有重要指导意义：首先，它解释了为何单纯靶向正构口袋的拮抗剂可能在临床中疗效有限或产生副作用，因为其无法完全抑制由变构激动剂和正构激动剂协同驱动的信号。其次，研究揭示了“ICL2位点”作为药物研发新靶点的巨大潜力，为开发选择性更高、作用机制全新的变构调节剂（如负变构调节剂NAM或双位点配体）提供了精准的分子蓝图，有望为哮喘、心血管疾病、癌症等CysLT₂R相关疾病的治疗带来新一代高效、安全的疗法。