酵母HEH1基因竞争性5'剪接位点选择性剪接的机制：U5/U6 snRNA解码与剪接体核心蛋白的调控作用

《Nature Communications》：Mechanism of alternative splicing of yeast HEH1 through competing 5’ splice sites

本研究揭示了酵母HEH1基因前体mRNA通过竞争性5'剪接位点（5'SS）进行选择性剪接的分子机制。研究人员发现U5和U6 snRNA在剪接体B到Bact转换过程中，通过碱基配对解码16核苷酸区域决定5'SS选择，而Hub1、RES复合物等蛋白因子起辅助稳定作用。该机制为真核生物中紧密相邻5'SS的交替使用提供了新见解。

　　

在真核生物中，一个基因能够通过选择性剪接产生多种mRNA异构体，从而显著增加蛋白质组的多样性。其中，通过竞争性5'剪接位点（5' splice site, 5'SS）进行的选择性剪接是一种普遍存在的调控方式。酿酒酵母的HEH1基因（也称为SRC1）含有两个部分重叠的竞争性5'SS，其序列为/GCAA/GUGAGU，这两个位点相距仅4个核苷酸。使用下游的/GUGAGU位点会产生编码全长蛋白Heh1L的mRNA，而使用上游的/GCAAGU位点则会产生编码截短蛋白Heh1S的mRNA。这两种蛋白在细胞核膜内具有不同的拓扑结构和功能。然而，这种紧密相邻的竞争性5'SS是如何被精确识别和选择的，其分子机制尚不清楚。

以往的研究表明，早期识别因子如U1 snRNA及相关蛋白在5'SS选择中起重要作用。但印度科学教育与研究学院莫哈利分校Shravan Kumar Mishra团队的前期工作发现，HEH1的选择性剪接需要类泛素蛋白Hub1与剪接体成分Prp5和Snu66的非共价结合。这暗示剪接体核心可能在HEH1的5'SS选择中扮演角色。为了深入探究其机制，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们构建了HEH1-LACZ和HEH1-CUP1两种选择性剪接报告基因系统，用于在体内监测5'SS的选择效率。通过酵母遗传学手段，包括基因敲除菌株、点突变菌株以及染色体融合菌株（将hub1-D22A与各种剪接因子C端融合），系统地筛选并验证了参与HEH1选择性剪接的反式作用因子。利用蛋白质免疫印迹（Western blot）和逆转录PCR（RT-PCR）结合cDNA测序，分别在蛋白质和mRNA水平上定量分析了Heh1异构体的表达量和比例。此外，研究人员还通过位点定向诱变技术，对HEH1前体mRNA的16核苷酸关键区域、U5 snRNA的loop 1以及U6 snRNA的ACAGA盒及其侧翼序列进行了系统性突变，并分析了这些突变对snRNA-pre-mRNA碱基配对强度及5'SS选择偏好的影响。最后，他们利用ACT1-CUP1单5'SS报告系统评估了特定序列背景下的剪接效率。

HEH1选择性剪接需要B和B^act复合物蛋白

研究人员通过报告基因筛选、蛋白质和mRNA异构体检测，发现除了已知的Hub1-Snu66复合物外，保留与剪接复合体（RES）的亚基（Snu17, Bud13, Pml1, Urn1）和十九复合体（NTC）因子Ecm2对于HEH1S 5'SS的选择至关重要。Prp8蛋白的prp8-101（E1960K）突变体也表现出选择性剪接缺陷。有趣的是，在缺乏这些蛋白因子的突变体中，HEH1L的表达反而增强，表明竞争机制的丧失使得主导位点被更高效地利用。通过将Hub1（D22A）与不同剪接因子进行染色体线性融合，发现当Hub1被锚定在剪接体B和B^act复合物的特定蛋白（如Snu66, Prp38, Prp8, Prp3, Prp6, Prp31）上时，能够恢复HEH1的选择性剪接，这揭示了这些核心剪接体蛋白在过程中的重要作用。

HEH1外显子-内含子边界的序列决定选择性5'SS的选择

研究人员将关注点聚焦于HEH1基因外显子-内含子边界的一个16核苷酸片段（1913-1928）。通过系统的点突变分析，他们发现该区域的核苷酸几乎不可变。更重要的是，5'SS的选择结果与它们和U5、U6 snRNA的预测碱基配对强度完美吻合，而与U1 snRNA的配对强度无关。当某个5'SS与U5或U6的配对增强时，它就成为优势位点，而另一个位点的使用则大幅减少。这表明U5和U6 snRNA的解码是5'SS选择的主要决定因素。

U5和U6 snRNA能够在不依赖蛋白因子的情况下促进选择性5'SS选择

为了直接验证U5/U6 snRNA的作用，研究人员构建了能与HEH1S或HEH1L 5'SS增强配对的snRNA变体。过表达这些变体（如U5 snRNA的U(98)C变体，U6 snRNA的A(45)U, U(46)C变体）确实在野生型酵母中偏向性增强了相应5'SS的选择。最关键的是，这些snRNA变体的过表达能够挽救△hub1、△snu17、△ecm2和△urn1等突变体中的选择性剪接缺陷。这表明，这些蛋白因子的作用可能是通过稳定snRNA与前体mRNA的相互作用来实现的，而增强的snRNA-pre-mRNA配对可以绕过对它们的需求。

Prp8-101表面对于处理“GC”供体至关重要

研究发现，prp8-101等位基因特异性地影响含有非经典“GC”供体（即5'SS起始为GC而非GU）且第二位或第三位为C（+2C或+3C）的5'SS的选择和/或催化。在prp8-101突变体中，含有/GCAUGU（+2C）或/GUCUGU（+3C）的5'SS使用效率低下。Prp8的RH结构域在剪接体从B复合物到B^act复合物的转换过程中发生构象变化，prp8-101突变可能影响了这一过程，从而无法有效支持对这类特殊5'SS的处理。

特定的竞争性5'SS允许在不依赖调控蛋白的情况下进行选择性剪接

理论推测，如果能够通过改变5'SS序列重新平衡它们与U5/U6 snRNA的配对，或许可以实现在没有调控蛋白情况下的选择性剪接。实验结果证实了这一设想。研究人员发现，某些HEH1前体mRNA变体（如#15，含有/GCAA/GUAUAU；#18，含有/GUAU/GUAUGU）在△hub1、△snu17等突变体中仍然能够进行选择性剪接。对于#18，其两个5'SS都是经典的“GU”起始，且与U6 snRNA配对强，因此不再需要Hub1、RES等蛋白因子的辅助。这进一步证明了RNA-RNA相互作用的核心地位。

Ecm2、Urn1和RES蛋白使较弱的5'SS进入竞争

通过使用HEH1S-CUP1报告系统进一步分析发现，Hub1和Prp8主要促进含有+2C的5'SS的选择，可能通过稳定U5/U6 snRNA在目标前体mRNA上的结合。而Snu17、Urn1和Ecm2则通过两种方式促进较弱5'SS的竞争：一是稳定snRNA-前体mRNA相互作用，二是通过削弱主导5'SS（HEH1L位点）的竞争力来间接使较弱位点（HEH1S位点）受益。

本研究最终得出结论：酵母HEH1基因竞争性5'SS的选择性剪接，其核心机制在于剪接体从B复合物向B^act复合物过渡期间，U5和U6 snRNA通过碱基配对解码前体mRNA上16核苷酸的关键区域。U6 snRNA不仅其经典的ACAGA盒与5'SS的+3至+6位核苷酸配对，其第45和46位核苷酸（ACAGA盒之外）也与5'SS的+7和+8位核苷酸配对，这对选择决策至关重要。而Hub1、RES复合物、Ecm2以及Prp8等蛋白因子，则通过稳定剪接体在较弱5'SS上形成一种低严谨性、高效率的构象，从而辅助这一选择过程。当snRNA与前体mRNA的配对经过重新校准而达到优化时，选择性剪接甚至可以独立于这些蛋白因子而发生。

这项研究的重要意义在于它挑战了早期识别因子（如U1 snRNP）在紧密相邻的竞争性5'SS选择中起主导作用的传统观点，而是强调了剪接体核心组分（U5/U6 snRNA）及其相关蛋白在催化激活前的关键阶段所起的决定性作用。由于人类基因组中约有1%的内含子使用“GC”作为5'供体，且本研究所涉及的调控蛋白在真核生物中高度保守，因此该机制很可能在高等真核生物中具有普适性，为理解广泛存在的选择性剪接现象提供了新的框架和视角。