H3K4me3与氧化应激的互作：改善辅助生殖技术来源胚胎质量的潜在靶点

《Nature Communications》：Crosstalk between H3K4me3 and oxidative stress is a potential target for the improvement of ART-derived embryos

本研究针对辅助生殖技术（ART）可能带来的不良妊娠结局，深入探讨了体外受精（IVF）与体内受精（IVO）来源的小鼠胚胎在转录组和表观遗传层面的差异。研究发现，囊胚期存在显著的H3K4me3（组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化）修饰差异，这与IVF囊胚中较高的氧化应激水平相关。引人注目的是，使用KDM5（组蛋白去甲基化酶）抑制剂CPI-455处理，可成功挽救H3K4me3标记和特定基因的转录水平，促进体外胚胎发育并改善妊娠结局。该研究揭示了H3K4me3与氧化应激之间的相互作用是改善ART胚胎质量的一个关键机制，为优化ART临床实践提供了新的视角和潜在靶点。

　　

随着社会发展和环境因素变化，不孕不育的患病率逐渐上升，辅助生殖技术（ART），主要包括体外受精（IVF）和卵胞浆内单精子注射（ICSI），已成为解决这一问题的重要途径。虽然大多数通过ART诞生的后代看起来是健康的，但许多研究也揭示了与ART相关的多种不良结局，例如低出生体重、胎盘异常、胰岛素敏感性受损以及白细胞端粒长度缩短等。然而，这些现象背后的潜在机制尚不完全清楚。在胚胎发育过程中，表观遗传景观，包括DNA甲基化、H3K4me3和H3K27me3，会发生剧烈而有规律的重构，确保基因的精确转录。因此，研究人员推测，ART操作过程中环境暴露和干预可能导致胚胎表观遗传的改变，进而引发不良后果。尽管已有研究在胎盘或脐带血等分娩时可获得的组织中观察到ART与自然受孕样本之间的表观遗传标记差异，但在更早期的发育阶段（如植入前和围植入期），ART受孕胚胎与自然受孕胚胎究竟有何不同，仍然知之甚少。理解这些差异可能为提高ART来源胚胎的质量、减少不良结局提供线索。

为此，发表在《自然·通讯》上的这项研究，利用小鼠模型，通过多组学分析，系统比较了通过IVF和体内受精（IVO）获得的植入前胚胎的差异，并深入探究了改善胚胎质量的潜在策略。

研究人员运用了多种关键技术方法来开展此项研究。他们收集了IVF和IVO来源的小鼠胚胎在不同发育阶段（从PN5合子到囊胚）的样本。通过Smart-seq2（一种高灵敏度的全长单细胞RNA测序技术）进行转录组分析，揭示了基因表达的动态变化和差异。利用超低输入天然染色质免疫共沉淀测序（ULI-NChIP-seq）技术，绘制了H3K4me3和H3K27me3这两种重要组蛋白修饰在囊胚期的全基因组分布图谱。通过全基因组甲基化测序（WGBS）分析了DNA甲基化水平的差异。此外，还建立了胚胎体外延迟培养系统，并对培养后的胚胎进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），以研究植入后早期胚胎的细胞组成和谱系分化情况。为了探究H3K4me3在胚胎发育中的作用，研究者在胚胎培养液中添加了KDM5组蛋白去甲基化酶的抑制剂CPI-455，并观察其对胚胎发育、表观遗传、转录组、氧化应激水平以及最终妊娠结局的影响。研究还涉及了针对活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）、NAD⁺、NADH和ATP水平的测定。在临床层面，研究团队进行了一项大样本回顾性队列研究，分析了医院数据库中数千个单囊胚移植周期的临床数据，比较了第5天（D5）和第6天（D6）囊胚移植的妊娠结局，并利用倾向评分匹配（PSM）来减少混杂因素的影响。同时，也初步探索了CPI-455处理对人类胚胎体外发育的影响。

中度转录差异存在于IVO和IVF来源的胚胎之间，晚期2细胞期除外

研究人员首先想知道IVF来源的胚胎在转录水平上与IVO来源的胚胎存在何种以及多大程度的差异。他们对从PN5到桑葚胚的多个阶段进行了Smart-seq2测序。主成分分析（PCA）结果显示了清晰的发育轨迹。总体而言，从PN5到桑葚胚，IVF和IVO之间的基因转录景观高度相似，但在晚期2细胞期观察到了显著的差异，这提示IVF可能干扰了合子基因组激活（ZGA）过程。

若干基因在IVF来源的囊胚中表达失调

研究重点关注了囊胚阶段，这是体外操作的通常终点，也是ART中移植入子宫的阶段。与先前研究一致，发现IVF来源的囊胚细胞数量较少。通过转录组分析，在IVF和IVO囊胚之间鉴定出697个差异表达基因（DEG）。功能分析显示，与“应答氧化应激”、“细胞氧化还原稳态”以及多种代谢过程相关的基因在IVF囊胚中表达失调。一致地，IVF囊胚表现出更高的活性氧（ROS）水平和更低的谷胱甘肽（GSH）、NAD⁺、NADH和ATP浓度，表明其存在更高的氧化应激和线粒体功能障碍。此外，内细胞团（ICM）标志基因（如Pou5f1和Nanog）表达降低，而滋养外胚层（TE）标志基因Eomes表达升高，这可能与ZGA过程中Carm1激活失败有关。

IVF来源囊胚中异常的表观遗传景观

在表观遗传层面，研究发现IVF囊胚中H3K4me3信号显著降低，且是全基因组范围的减少。相比之下，H3K27me3信号在IVF囊胚中略有升高，但差异远小于H3K4me3。利用chromHMM对染色质状态进行建模分析发现，在IVF囊胚中，抑制性状态（由H3K27me3标记）区域长度增加，而活性状态（由H3K4me3标记）区域长度减少。同时，兼具H3K4me3和H3K27me3标记的二价染色质状态在两组囊胚间变异很大，这种破坏可能会影响后续发育过程中的基因精确调控。此外，IVF囊胚还具有较低的DNA甲基化水平，并存在差异甲基化区域（DMR）。

IVF来源的植入后胚胎中存在异常的细胞组成

为了探究囊胚期观察到的差异对后续发育的影响，研究人员将IVF和IVO来源的囊胚进行体外延迟培养，模拟体内E6.5-E7.5阶段的胚胎。单细胞RNA测序分析鉴定出11种细胞类型，分别对应于/起源于上胚层、原始内胚层和滋养外胚层。有趣的是，发现IVF来源的胚胎中，处于更分化状态的滋养层细胞（如滋养层巨细胞TGC和海绵滋养层SpT）比例较高，而上胚层细胞比例较低。这种细胞比例的失衡可能预示着胎儿和胎盘比例的异常。

CPI-455处理改善小鼠妊娠结局

鉴于IVF和IVO囊胚间巨大的H3K4me3差异，研究人员尝试从H3K4me3的角度改善IVF胚胎质量。在胚胎体外培养过程中添加不同浓度的KDM5抑制剂CPI-455，发现5μM的CPI-455能增加H3K4me3水平，并促进囊胚形成。进一步机制探讨表明，CPI-455处理成功挽救了部分基因（称为成功挽救基因，SRG）的表达，这些基因功能与“氧化磷酸化”、“ATP代谢过程”等相关。相应地，CPI-455处理降低了氧化应激水平，恢复了线粒体功能。研究还证实氧化应激本身可影响H3K4me3强度，形成了H3K4me3与氧化应激之间的交互对话。胚胎移植实验证实，CPI-455处理显著提高了IVF胚胎的出生率和活产率。作为对比，抗氧化剂NMN（烟酰胺单核苷酸）处理也显示出类似的改善效果。

CPI-455处理促进人类胚胎发育

在人类胚胎中，研究发现发育较快的第5天（D5）囊胚比第6天（D6）囊胚具有更高的H3K4me3信号和更低的ROS水平。临床数据分析表明，D5囊胚移植的生化妊娠率、临床妊娠率和活产率均显著高于D6囊胚。将CPI-455应用于人类胚胎体外培养，发现其能提高第3天优质胚胎率和第5/6天囊胚形成率。转录组分析鉴定出的人类CPI-455敏感基因，其功能与小鼠中的SRGs相似，提示CPI-455的作用机制在人和小鼠间可能具有保守性。

研究结论与意义

本研究系统揭示了IVF与IVO来源的小鼠胚胎在植入前和植入后早期阶段在转录组和表观遗传（尤其是H3K4me3）层面的显著差异。研究首次阐明了H3K4me3与氧化应激在ART胚胎发育中存在重要的相互作用：体外操作和暴露导致氧化应激升高，进而可能通过影响组蛋白甲基转移酶活性等方式降低H3K4me3水平；而H3K4me3的异常又会影响线粒体功能等相关基因的表达，加剧代谢和氧化应激失衡。干预这一环节（如使用CPI-455或NMN）可有效改善胚胎质量和妊娠结局。该研究不仅深化了对ART潜在风险机制的理解，更重要的是为优化ART培养体系、筛选优质胚胎以及提高ART成功率和子代安全性提供了新的表观遗传靶点和潜在策略，具有重要的理论价值和临床转化前景。