活体患者皮肤来源ATTRv-F64S淀粉样纤维结构解析揭示跨组织保守性及诊断潜力

《Nature Communications》：Structure of ATTRv-F64S fibrils isolated from skin tissue of a living patient

本研究针对遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTRv）诊断侵入性强、缺乏活体患者纤维结构数据的难题，研究人员通过皮肤活检从携带罕见F64S突变的活体患者体内成功提取ATTR淀粉样纤维，利用冷冻电镜（cryo-EM）首次解析其高分辨率结构（2.8 ?），发现该结构与不同组织来源的ATTR纤维高度保守，证实皮肤活检可作为非侵入性诊断工具，并为基于纤维结构的个性化免疫治疗设计提供新思路。

　　

在生命科学领域，系统性淀粉样变性是一类令人棘手的 degenerative disease（退行性疾病），其中由转甲状腺素蛋白（Transthyretin, TTR）错误折叠形成的淀粉样纤维沉积在心脏、肾脏、肝脏和皮肤等器官中，导致器官功能逐渐丧失。这类疾病分为遗传性（ATTRv）和野生型（ATTRwt）两种，其中ATTRv由TTR基因突变引起，目前已发现超过200种致病突变。尽管科学家们通过尸检组织获得了多种ATTR纤维的冷冻电镜结构，但活体患者来源的纤维结构信息一直缺失，这限制了对疾病机制的理解和精准诊疗策略的开发。

以往的研究多依赖于心脏、神经等尸检组织，样本获取具有侵入性且无法反映疾病早期阶段的纤维特征。此外，不同组织来源的ATTR纤维是否存在结构差异、罕见突变如何影响纤维形成等问题也悬而未决。因此，开发一种微创、可重复的活体采样方法，并在此基础上解析纤维结构，对实现早期诊断、揭示致病机制以及开发个体化治疗策略具有重要意义。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Jun Yu、Xuefeng Zhang等研究人员另辟蹊径，将目光投向了皮肤这一易于获取的活体组织。他们从一名携带罕见F64S突变的ATTRv多发性神经病患者身上，通过穿刺活检获取了脚踝和大腿部位的皮肤组织（样本量仅5-10毫克）。利用免疫组织化学、质谱分析和冷冻电镜等技术，团队首次成功地从活体患者皮肤中提取并解析了ATTRv-F64S淀粉样纤维的三维结构。

关键技术方法包括：对患者脚踝和大腿进行皮肤活检获取样本；采用水提法从组织中提取淀粉样纤维以保持其天然结构；通过负染电镜和SDS-PAGE评估纤维的纯度和丰度；利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析纤维的蛋白组成、突变比例和翻译后修饰（PTMs）；最后通过冷冻电镜单颗粒分析和螺旋重建技术解析纤维的高分辨率结构。

Characterisation of ATTR fibrils from ankle and thigh skin biopsies of a living patient

研究人员首先对患者脚踝和大腿的皮肤组织进行表征。刚果红染色和偏振光显微镜观察证实两个部位均存在淀粉样沉积，主要位于表皮下层和真皮层，尤其是小动脉和汗腺周围。值得注意的是，脚踝组织的刚果红染色强度和双折射信号均强于大腿组织，提示脚踝部位有更丰富的淀粉样纤维沉积。PGP9.5抗体染色显示两个样本的表皮内神经纤维密度均降低，证实患者存在小纤维神经病变。通过水提法从组织中分离出淀粉样纤维，SDS-PAGE和负染电镜分析进一步验证了脚踝组织来源的纤维量更大。

Characterisation of ATTRv-F64S fibrils by mass spectrometry

团队利用高灵敏度LC-MS/MS对极少量（300纳克和30纳克）的纤维样本进行了 bottom-up（自下而上）蛋白质组学分析。结果近乎完全覆盖了TTR蛋白的成熟形式（覆盖率最高达98.4%），并成功检测到包含F64S突变位点的肽段。定量分析显示，在形成的淀粉样纤维中，携带F64S突变的TTR比例显著高于野生型TTR，表明该突变可能通过 destabilizing（ destabilizing）天然TTR折叠而促进纤维形成。此外，研究还 unbiased（无偏倚）地鉴定出14种位于9个位点的翻译后修饰（PTMs），包括磷酸化、乙酰化、泛素化等，其中10种为首次在ATTR纤维中发现。例如，K15乙酰化在脚踝组织纤维中更为富集，而T49磷酸化和K70乙酰化则特异性地出现在突变型TTR上。

Cryo-EM structure of ATTRv-F64S fibrils

对脚踝组织提取的纤维进行冷冻电镜分析，获得了约2.8 ?分辨率的三维结构。重构出的纤维主要由单一原纤维构成，也存在少量扭曲的双原纤维形式。单原纤维结构呈现典型的"矛头状"折叠，由N端片段（C10-A36）和C端片段（G57-N124）组成，中间区域（A37-H56）因柔性较高未能解析。每个原纤维层包含10条β-折叠片（β-strands），通过广泛的疏水相互作用、氢键和π-π堆积作用维持稳定。静电表面电势分析发现了两个带负电的区域。尽管F64S突变位于结构的"gate region（门控区域）"（G57-G67），但该区域呈现出最常见的"closed gate（关闭状态）"构象，可能由S64与E61之间形成的氢键所稳定。

Structural consistency of ATTR fibrils across various tissue types

将ATTRv-F64S纤维结构与蛋白质数据库（PDB）中所有已发表的ATTR纤维结构（包括来自心脏的ATTRwt和多种ATTRv突变体，以及来自眼睛的ATTRv-V30M纤维）进行比对后发现，尽管门控区域存在局部构象差异（如开放、关闭、阻断、断裂、缺失五种状态），但所有ATTR纤维的整体折叠结构高度保守。ATTRv-F64S纤维与大多数ATTR纤维一样，门控区域呈关闭状态，而ATTRv-I84S心脏纤维则表现出四种不同的门控构象，ATTRv-V30M眼内纤维呈现独特的"blocking gate（阻断状态）"。位于极性空腔的K80乙酰化可能通过与T59形成氢键而稳定关闭状态，而Y116磷酸化则可能影响原纤维间的相互作用。

研究结论与意义

本研究首次从活体患者的皮肤活检组织中成功解析出ATTRv-F64S淀粉样纤维的冷冻电镜结构，证明了利用微创皮肤活检获取高质量结构生物学样本的可行性。研究揭示了ATTR纤维在不同组织和不同基因突变背景下具有惊人的结构保守性，这为皮肤活检作为ATTR淀粉样变性的非侵入性诊断、分型和结构分析工具提供了强有力的证据。研究发现突变型TTR在纤维中占比更高，并鉴定出多个可能与纤维形成调控相关的PTMs，为理解ATTR纤维形成的分子机制提供了新视角。此外，活体患者来源的纤维结构使得在不同基因型、表型和疾病阶段进行纵向研究成为可能，有助于揭示纤维随时间和治疗干预的演化规律。最重要的是，这项工作为开发针对特定纤维构象和表位谱的个性化免疫治疗策略（如设计靶向淀粉样纤维的迷你蛋白、肽段或纳米抗体）奠定了结构基础，有望推动针对已形成淀粉样沉积的清除疗法的发展，为ATTR淀粉样变性的精准医疗开辟了新途径。