TRIM37-PARP1-TET1轴通过5hmC调控抑制DNMT1可变剪接以维持干细胞特性并防治骨质疏松

《Nature Communications》：TRIM37–PARP1–TET1 axis maintains stemness and prevents osteoporosis by inhibiting DNMT1 alternative splicing via 5hmC regulation

本研究揭示了TRIM37-PARP1-TET1信号轴在维持间充质干细胞（MSC）干性和防治骨质疏松中的关键作用。研究人员发现该轴通过调控DNA羟甲基化（5hmC）水平，抑制DNMT1基因的可变剪接，从而维持MSC的自我更新和成骨分化能力。联合使用ATM激活剂（白藜芦醇）和TET激活剂（维生素C）可有效 rejuvenate衰老MSC，并在老年小鼠模型中显著改善骨密度和促进骨修复。该研究为骨质疏松等年龄相关骨疾病的治疗提供了新的靶点和策略。

　　

随着年龄增长，我们的骨骼会变得脆弱，更容易骨折，这就是骨质疏松症。这种常见的年龄相关性疾病给全球老龄化社会带来了巨大的健康负担。骨骼的健康维持依赖于骨组织中一群特殊的“种子”细胞——间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）。这些细胞具有自我更新能力，并能分化为成骨细胞（负责骨形成）和脂肪细胞等。然而，如同体内许多其他细胞一样，MSCs也会随着个体衰老或在体外长期培养过程中逐渐进入复制性衰老（Replicative Senescence）状态，表现为增殖停滞、分化潜能受损以及分泌一系列衰老相关因子。MSCs的衰老被认为是骨质疏松发生发展的重要细胞学基础。因此，深入理解MSCs衰老的分子机制，寻找维持其干性（Stemness）和功能的方法，对于防治骨质疏松具有重要意义。

近年来，表观遗传调控在细胞衰老和干细胞功能维持中的作用日益受到关注。DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶, 5mC）是一种重要的表观遗传标记，而ten-eleven translocation（TET）家族酶（TET1/2/3）能将5mC氧化生成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），这一过程被视为主动去甲基化的起始步骤。5hmC不仅是一个中间产物，其本身在基因转录调控、胚胎发育、细胞多能性维持以及组织特异性功能中扮演着关键角色。在造血干细胞（HSCs）和神经干细胞等成体干细胞中，5hmC的动态变化对于其稳态至关重要。然而，5hmC在人间充质干细胞衰老过程中的具体作用及其调控机制尚不清晰。

与此同时，DNA损伤应答（DNA Damage Response, DDR）通路也与细胞衰老密切相关。长期培养的MSCs会出现DNA双链断裂（DSBs）的累积和DDR功能受损。DDR核心蛋白如ATM（Ataxia Telangiectasia Mutated）和PARP1 [Poly(ADP-ribose) Polymerase 1] 被认为是潜在的治疗靶点，但它们在MSCs衰老中的具体功能，特别是与表观遗传修饰之间的交叉对话，仍有待阐明。

在此背景下，由中国医科大学洪士杰（Shih-Chieh Hung）教授团队领导的研究，在《Nature Communications》上发表了一项重要研究，揭示了TRIM37-PARP1-TET1信号轴通过调控DNA羟甲基化水平，进而影响DNA甲基转移酶1（DNMT1）的可变剪接，从而维持MSC干性并防止骨质疏松的新机制。该研究不仅阐明了5hmC在MSCs衰老中的核心地位，还发现了连接DDR与表观遗传调控的全新通路，并为骨质疏松的干预提供了新的潜在策略。

为开展此项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。研究使用了从接受骨科手术患者（台北荣民总医院伦理委员会批准）获取的人骨髓来源MSCs进行体外培养和衰老模型构建。关键实验技术包括：利用慢病毒介导的基因敲低（Knockdown, KD）和过表达（Overexpression, OE）技术调控目标基因（如TET1, TET2, PARP1, CTCF, TRIM37, DNMT1）的表达；通过蛋白质印迹（Western Blotting）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）和邻位连接技术（Proximity Ligation Assay, PLA）分析蛋白质表达、相互作用和定位；采用甲基化DNA免疫共沉淀测序（MeDIP-seq）、羟甲基化DNA免疫共沉淀测序（hMeDIP-seq，但数据不理想）和染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）以及RNA测序（RNA-seq）进行全基因组表观遗传和转录组分析；通过5‘-cDNA末端快速扩增（5’-RACE-PCR）和复制多元转录本剪接分析（rMATS）鉴定DNMT1的可变剪接事件；利用体外DNA甲基转移酶活性检测试剂盒分析DNMT1酶活；并构建了TRIM37和PARP1基因敲除（KO）小鼠模型，通过微型电子计算机断层扫描（Micro-CT）和骨损伤修复模型（皮质钻孔结合钙黄绿素标记）进行体内骨密度和骨再生能力评估。

研究结果

早期人MSCs显示较高的5hmC水平，从而表现出增加的增殖和分化潜能

研究人员首先发现，与晚期（P10-12）MSCs相比，早期（P2-4）MSCs具有更高的全局性5hmC水平，而5mC水平则相对较低。使用TET酶抑制剂2-羟基戊二酸（2-HG）处理早期MSCs，可降低其5hmC水平，并显著抑制其增殖能力以及向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。这表明5hmC水平对维持早期MSCs的功能至关重要。

TET1敲低降低5hmC水平，并抑制早期人MSCs的增殖和分化潜能

为了明确TET1和TET2的作用，研究团队利用短发夹RNA（shRNA）分别敲低TET1和TET2。结果显示，敲低TET1能更显著地降低早期MSCs中的5hmC水平，并抑制其增殖和分化能力，而敲低TET2的影响相对较小。这表明TET1是维持早期MSCs中5hmC水平及其功能的主要酶。

PARP1/TET1复合物调控早期人MSCs的增殖和分化潜能

研究发现PARP1与TET1在早期MSCs中存在内源性相互作用。早期MSCs的PARP1蛋白水平高于晚期MSCs。敲低PARP1会降低早期MSCs的5hmC水平，上调衰老标志物p16^Ink4a和p21^Waf1/Cip1的表达，并损害其增殖和分化能力。相反，在晚期MSCs中过表达PARP1则能提升5hmC水平，降低衰老标志物表达，并增强细胞功能。重要的是，TET1的敲低可以逆转PARP1过表达带来的益处，证明PARP1的功能依赖于TET1。

MeDIP和ChIP-seq揭示PARP1/TET1的多个下游靶点，包括DNMT1的可变剪接

为了寻找PARP1/TET1复合物的下游靶点，研究人员进行了MeDIP-seq（比较早期和晚期MSCs的DNA甲基化差异）以及PARP1和TET1的ChIP-seq（在早期MSCs中）。分析发现，有20个基因在晚期MSCs中高甲基化，并且其基因组区域在早期MSCs中同时被PARP1和TET1结合。其中之一便是对MSC干性维持至关重要的DNMT1基因。ChIP-PCR证实PARP1和TET1结合在DNMT1基因的转录起始位点（TSS）附近。敲低PARP1或TET1会降低全长DNMT1蛋白水平。MeDIP-seq数据显示，在晚期MSCs中，DNMT1基因的多个外显子（如21, 30, 35, 36, 37, 39）呈现高甲基化状态，这些外显子恰好位于DNMT1的催化结构域。通过5‘-RACE-PCR和RNA-seq剪接分析，研究人员证实晚期MSCs或敲低PARP1/TET1的早期MSCs中，确实产生了DNMT1的可变剪接异构体（AS-DNMT1），该异构体跳过了从外显子30到37的序列。

CTCF参与PARP1/TET1复合物介导的基因内DNA去甲基化并阻止DNMT1可变剪接

研究进一步发现，PARP1/TET1复合物与染色质绝缘子蛋白CTCF存在相互作用。生物信息学预测和ChIP实验表明，CTCF结合位点位于DNMT1基因内那些在晚期MSCs中高甲基化的外显子区域（如30和37）。在晚期MSCs或敲低PARP1/TET1的早期MSCs中，CTCF在这些外显子上的结合显著减少。敲低CTCF本身也会导致全长DNMT1蛋白水平下降，并诱导产生DNMT1的可变剪接mRNA。这表明，PARP1/TET1复合物通过去甲基化DNMT1基因的特定内含子区域，为CTCF的结合创造了条件，而CTCF的结合有助于防止这些外显子在转录过程中被错误剪接。

DNMT1可变剪接形式促进人MSCs衰老并降低干性

为了探究AS-DNMT1的功能，研究人员在293T细胞中表达并纯化了全长DNMT1（Full-DNMT1）和剪接异构体（AS-DNMT1）蛋白。体外酶活实验显示，AS-DNMT1自身的甲基转移酶活性仅为全长蛋白的约三分之一，并且它能以剂量依赖的方式抑制Full-DNMT1的活性。在早期MSCs中过表达AS-DNMT1，会增加衰老标志物p16^Ink4a和p21^Waf1/Cip1的表达，抑制细胞增殖，并削弱其成骨和成脂分化能力。这表明AS-DNMT1不仅功能不全，还能显性负性地抑制全长DNMT1的功能，从而促进MSCs衰老。

T203磷酸化是TRIM37通过K337单泛素化稳定PARP1所必需的

为了寻找PARP1的上游调控因子，研究人员通过免疫共沉淀结合质谱（IP-MS/MS）分析，发现早期MSCs中与PARP1相互作用的磷酸化蛋白包括磷酸化TRIM37（第203位苏氨酸，T203）。实验证实TRIM37与PARP1存在相互作用，并且TRIM37能作为E3泛素连接酶，催化PARP1第337位赖氨酸（K337）的单泛素化，这种修饰能稳定PARP1蛋白。将TRIM37的T203位点突变为不能磷酸化的丙氨酸（T203A），会削弱TRIM37与PARP1的结合、PARP1的泛素化及其稳定性；而突变为模拟磷酸化的谷氨酸（T203E）则增强这些效应。在早期MSCs中敲低TRIM37，会降低PARP1和全长DNMT1的蛋白水平，上调衰老标志物，并损害细胞增殖和分化。回补实验证明，只有回补野生型（WT）或T203E突变型TRIM37才能挽救TRIM37敲低引起的表型，而T203A突变体则不能，表明T203磷酸化对TRIM37的功能至关重要。

ATM通过T203磷酸化上调TRIM37蛋白水平及其与PARP1的核内相互作用

研究发现，早期MSCs中活化的ATM（p-ATM, Ser1981位点磷酸化）和TRIM37的水平更高。使用ATM抑制剂KU-55933处理早期MSCs会降低TRIM37、PARP1和全长DNMT1的水平；而使用ATM激活剂白藜芦醇（Resveratrol）处理中年传代（P7-9）MSCs则能提升这些蛋白的水平。免疫荧光和邻位连接技术（PLA）显示，在早期MSCs中，p-ATM、TRIM37和PARP1在细胞核内的共定位更显著，并且TRIM37与p-ATM以及TRIM37与PARP1之间的相互作用更强。白藜芦醇处理能增强这些蛋白在核内的相互作用。此外，在293T细胞中表达TRIM37 T203E突变体能促进其核转位，而T203A突变体则抑制核转位。这表明ATM通过磷酸化TRIM37的T203位点，促进其进入细胞核并与PARP1形成功能复合物。

ATM激活剂联合TET激活剂维持全长DNMT1并促进MSC干性

基于上述机制，研究人员假设联合使用ATM激活剂（白藜芦醇）和TET激活剂（维生素C）可能协同改善MSCs的干性。实验证明，在含10%胎牛血清（FBS）或2%人血小板裂解物（hPL）的无血清培养基中，联合用药能显著提高MSCs的累积群体倍增水平（PDL），并增强其成骨和成脂分化能力。联合治疗还能在晚期MSCs中维持更高的全长DNMT1蛋白水平，并降低衰老标志物表达。

TRIM37和PARP1参与体内MSC衰老和功能

从年轻（<8周）和年老（6-10个月）小鼠分离的骨髓MSCs（BM-MSCs）显示，年轻小鼠的MSCs中TRIM37、PARP1、全长DNMT1水平更高，衰老标志物水平更低。与野生型（WT）小鼠相比，从TRIM37或PARP1基因敲除（KO）年轻小鼠分离的BM-MSCs表现出衰老标志物表达增加、增殖和分化潜能下降等衰老表型。

TRIM37和PARP1影响MSC维持骨稳态的能力并有助于体内骨修复

Micro-CT分析显示，年老小鼠（53周以上）与年轻小鼠（12周）相比，股骨远端骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Trabecular No.）均下降，骨小梁分离度（Tb. Sp.）增加。值得注意的是，年轻的TRIM37 KO小鼠也表现出与年老WT小鼠相似的骨量下降表型。在小鼠股骨骨干制造单皮质钻孔损伤后，年轻WT小鼠显示出连续的新骨形成（钙黄绿素荧光标记），而年老小鼠、TRIM37 KO或PARP1 KO小鼠的新骨形成则减少且不连续。这表明TRIM37和PARP1对于MSCs介导的骨稳态维持和损伤修复至关重要。

ATM激活剂和TET激活剂的组合促进体内骨修复并表现出抗骨质疏松作用

在老年（75周龄起始）雌性小鼠中，每日给予白藜芦醇和/或维生素C治疗8周。Micro-CT分析显示，与对照组或单一治疗组相比，联合治疗组小鼠股骨远端的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量和厚度均显著增加，骨小梁分离度降低。在79周龄时于股骨制造钻孔损伤，联合治疗组在损伤部位显示出更强的钙黄绿素荧光，表明其骨修复能力更强。各组间脂肪含量无显著差异。

研究结论与意义

本研究系统阐明了TRIM37-PARP1-TET1轴在维持人间充质干细胞干性和防治骨质疏松中的核心作用。该通路整合了DNA损伤应答（ATM-TRIM37）和表观遗传调控（PARP1-TET1-5hmC）两条关键路径，通过调控CTCF介导的DNMT1基因可变剪接，最终影响DNMT1的完整功能和MSCs的衰老进程。

这项研究的创新性和重要意义在于：首先，它首次明确了5hmC和TET1在人间充质干细胞复制性衰老中的关键作用，并将DNA羟甲基化与DNA损伤应答通路联系起来。其次，研究揭示了DNMT1通过产生功能缺陷的可变剪接异构体来促进细胞衰老的新机制，这不仅解释了DNMT1水平下降的原因，也提示了其功能的复杂性。第三，发现了TRIM37通过T203磷酸化依赖的方式调控PARP1稳定性这一新颖的分子事件，扩展了对E3泛素连接酶TRIM37功能的认识。第四，研究不仅停留在机制探索，还成功验证了联合使用ATM激活剂（白藜芦醇）和TET激活剂（维生素C）这种潜在的“鸡尾酒”疗法，能够在体外逆转MSCs的衰老表型，并在老年动物模型中有效改善骨质量和促进骨再生，为骨质疏松的临床干预提供了新的、具有转化前景的策略。最后，该研究强调了表观遗传调控和DDR在成体干细胞衰老中的重要性，为理解其他组织干细胞衰老及相关退行性疾病的机制提供了新思路。

总之，这项发表于《Nature Communications》的工作深刻揭示了连接表观遗传、DNA损伤应答与干细胞衰老的精密调控网络，为防治年龄相关性骨质疏松等疾病开辟了新的研究方向和治疗途径。