核糖体通过EF-G结合而非GTP水解驱动mRNA易位与解旋的机制研究

《Nature Communications》：The ribosome derives the energy to translocate and unwind mRNA from EF-G binding

本研究针对核糖体易位过程中EF-G介导的GTP水解作用机制这一长期争议问题，利用单分子荧光光镊技术同步监测EF-G结合、mRNA二级结构解旋和30S亚基头部旋转等关键事件。研究发现mRNA解旋和易位并不依赖GTP水解，而是由EF-G与核糖体的"紧密结合"所驱动，GTP水解仅通过降低EF-G亲和力促进其解离。该成果重新定义了翻译延伸的能量耦合机制，为理解核糖体分子马达工作原理提供新范式。

　　

在蛋白质合成的精密机器中，核糖体如同一个高度协调的分子马达，每读取一个密码子就需要完成一次称为"易位"的机械运动。这个过程涉及信使RNA（mRNA）和转移RNA（tRNA）相对于核糖体的协同移动，同时还需要解开mRNA可能形成的二级结构。伸长因子G（EF-G）作为关键的催化因子，其通过水解鸟苷三磷酸（GTP）提供的能量一直被普遍认为是驱动这一过程的主要动力来源。然而，关于GTP水解究竟在易位过程的哪个阶段发挥作用，以及其能量是如何被精确利用的，科学界长期存在激烈争议。

传统观点认为，GTP水解像一次"动力冲程"直接推动mRNA和tRNA的机械运动。但近年来的研究暗示，GTP水解可能主要作用于EF-G从核糖体上的解离，而非直接驱动机械运动。这一根本性问题关系到我们对细胞能量转换机制的基本理解，也影响着对多种抗生素作用机制的解释。由于缺乏能够同时监测化学事件（如EF-G结合）和机械事件（如mRNA移动）的高精度技术，这一争议一直未能得到圆满解决。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，加州大学伯克利分校和圣克鲁兹分校的研究团队开发了一种革命性的单分子技术——结合荧光检测的光镊系统（fleezers），能够以前所未有的时空分辨率同时观察EF-G与核糖体的结合动态以及mRNA的易位过程。通过这一技术，研究人员得以直接验证一个大胆的假设：核糖体可能主要利用EF-G结合本身释放的能量，而非GTP水解，来驱动mRNA的解旋和易位。

研究团队主要运用了高分辨率双光阱光镊结合单分子荧光检测（fleezers）技术，通过mRNA发夹解旋实验和辅助力实验两种几何构型，同时监测Cy3标记的EF-G结合动力学与mRNA运动。利用EF-G突变体（H92A、H92Q）、核糖体蛋白L7/L12突变体（V67D）及GTP类似物（GDPNP、GTPγS）等扰动手段，结合单分子FRET监测30S亚基头部旋转动态，系统分析了GTP水解和无机磷酸（P_i）释放在各步骤中的能量学作用。

同时监测发夹解旋与EF-G结合

研究人员首先建立了mRNA发夹解旋实验系统，将包含发夹结构的mRNA通过DNA手柄连接在两个微球之间，利用光镊监测核糖体逐步解开发夹的过程，同时通过共聚焦显微镜监测荧光标记的EF-G与核糖体的结合。通过精确测量EF-G结合至发夹解旋的时间（τ_unwinding）以及解旋至EF-G释放的时间（τ_release），研究人员发现在正常条件下（1mM GTP），τ_unwinding约为72±45毫秒，τ_release约为380±230毫秒。

发夹解旋不需要EF-G介导的GTP水解或P_i释放

为检验GTP水解在发夹解旋中的作用，研究团队使用GTP与不可水解类似物GDPNP的混合溶液。结果显示，尽管EF-G在核糖体上的停留时间显著延长（从几百毫秒至数十秒），但发夹解旋时间τ_unwinding分布与单独使用GTP时相比无显著变化，而τ_release则明显延长。类似地，使用缓慢水解的GTPγS或EF-G突变体（H92A、H92Q）也得到一致结果：解旋时间对GTP水解扰动不敏感，而释放时间显著延长。核糖体蛋白L7/L12突变体（V67D）实验进一步证实，延缓P_i释放仅影响EF-G解离而不影响解旋。这些结果表明，mRNA发夹解旋不依赖于GTP水解或P_i释放，而这些步骤对EF-G从核糖体上的解离至关重要。

非生产性EF-G结合事件不需要GTP水解

研究还观察到部分EF-G结合事件后未发生发夹解旋即解离，这些"非生产性"事件的停留时间（τ_unproductive）约为300±80毫秒，且不受GTP水解扰动的影响。这与生产性事件中EF-G释放对水解的依赖性形成鲜明对比，提示EF-G可能先以"松散"模式可逆结合，在生产性事件中转为"紧密"结合模式，后者需要GTP水解来实现解离。

发夹解旋与30S头部前向旋转时间相关

为探讨发夹解旋的结构基础，研究人员在30S亚基的头部和主体结构域分别标记荧光基团，通过FRET监测头部旋转动态。结果显示，发夹解旋与FRET从高到低的变化（对应头部前向旋转）在时间上高度吻合，平均FRET在解旋前几毫秒开始下降，在解旋时达到最低点，然后缓慢恢复。拟合分析得前向旋转速率约为115±30 s^-1，反向旋转速率约为5.3±0.4 s^-1，与既往研究一致。

发夹解旋非mRNA相对于30S主体易位的结果

为明确发夹解旋与mRNA易位的关系，团队设计了"辅助力实验"，直接监测mRNA相对于30S主体的运动与EF-G结合的时序关系。结果显示，在正常条件下，mRNA相对于30S主体的易位（τ_pre）稍晚于发夹解旋，但两者时间相近。然而，在GTP水解扰动条件下，τ_pre显著延长（1-3秒），而发夹解旋时间保持不变，表明两者可被解耦，解旋可先于mRNA-主体易位发生。这一结果说明mRNA-主体易位并非驱动发夹解旋的原因。

mRNA相对于30S主体的易位受GTP水解加速但不依赖它

辅助力实验显示，GTP水解扰动同时延长了τ_pre（结合至易位）和τ_post（易位至释放），表明GTP水解动力学加速了mRNA-主体易位，但非其热力学必要条件。最可能的解释是：GTP水解催化了易位过程，而P_i释放为EF-G解离提供能量。

本研究通过精密的单分子实验证明，核糖体进行mRNA解旋和易位所需的能量主要来源于EF-G与核糖体的紧密结合，而非传统认为的GTP水解。GTP水解的作用在于催化易位过程并促进EF-G解离，而非直接为机械运动供能。这一发现重新定义了我们对蛋白质合成能量耦合机制的理解，提出了一个全新的模型：EF-G结合能驱动早期易位事件，GTP水解和P_i释放则用于解除EF-G的紧密结合状态，完成 translocation 循环。

该研究的意义在于解决了长期存在的能量耦合机制争议，为理解核糖体分子马达的工作原理提供了全新视角。研究揭示的EF-G核苷酸交换能力以及多种结合模式也为开发新型翻译抑制剂提供了理论依据。此外，研究所建立的高精度单分子技术平台为今后研究其他生物分子机器的能量转换机制奠定了方法学基础。