巩膜Wnt5ahi成纤维细胞减少通过破坏细胞外基质稳态加剧小鼠近视进展

《Nature Communications》：Decreased scleral Wnt5ahi fibroblasts exacerbate myopia progression by disrupting extracellular matrix homeostasis in mice

本研究针对近视发病机制不清的难题，聚焦巩膜细胞异质性，发现巩膜中高表达Wnt5a的独特成纤维细胞亚群（Wnt5ahi成纤维细胞）在形觉剥夺性近视（FDM）小鼠中数量显著减少。通过AAV介导的基因干预实验证实，抑制Wnt5a或下游靶点Sparc表达会破坏巩膜胶原稳态，诱导近视进展；而过表达Wnt5a可抑制FDM发展。该研究首次揭示了Wnt5ahi成纤维细胞通过Wnt5a-CaMKII-ECM信号轴维持巩膜ECM稳态的新机制，为近视干预提供了新型潜在靶点。

　　

在全球范围内，近视已成为严重的公共卫生问题，尤其在东亚地区，青少年近视患病率已超过90%，达到流行病的程度。高度近视常伴随脉络膜新生血管、黄斑变性、视网膜脱离、青光眼等并发症，可能导致不可逆的视力丧失甚至失明。近视的主要特征是眼轴过度伸长和后部巩膜变薄，这些改变与巩膜细胞外基质（ECM）稳态失衡密切相关。然而，近视发病的具体细胞和分子机制尚未完全阐明，现有治疗手段对控制近视进展的效果仍不理想。

巩膜主要由成纤维细胞组成，这些细胞负责分泌胶原等ECM成分，维持巩膜的生物力学特性。研究表明，成纤维细胞具有高度的异质性，不同亚群在组织稳态和疾病中发挥特定作用。但在近视发展中，巩膜成纤维细胞是否存在功能特异的亚群，以及这些细胞如何调控ECM稳态，仍是未解之谜。

为解决这一问题，温州医科大学周翔天、赵福新团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，首次绘制了形觉剥夺性近视（FDM）小鼠巩膜细胞的基因表达图谱，并发现了一个表达Wnt5a的独特巩膜成纤维细胞亚群（Wnt5a^hi成纤维细胞）。该细胞亚群在近视发展中数量显著减少，并通过Wnt5a-Sparc信号轴调控巩膜ECM稳态，从而影响近视进展。

研究的关键技术方法包括：对形觉剥夺性近视小鼠模型进行巩膜单细胞RNA测序分析；通过RNA原位杂交（RNA FISH）和免疫荧光验证目标细胞的空间分布；利用腺相关病毒（AAV）介导的基因敲降（shWnt5a-AAV， shSparc-AAV）和过表达（Wnt5a-AAV）技术在体干预目标基因；采用透射电子显微镜观察巩膜胶原纤维超微结构；结合巩膜组织批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据和人类巩膜成纤维细胞（HSFs）体外实验进行机制验证。

单细胞表达谱特征揭示可变巩膜细胞亚型

研究人员对FDM小鼠巩膜进行scRNA-seq分析，共获得39，884个细胞，鉴定出10种主要细胞类型，其中成纤维细胞可进一步分为16个亚群。大多数巩膜成纤维细胞具有组织特异性，但也存在普遍性亚型（如Pi16⁺和Col5a1⁺）。这一发现表明鼠巩膜成纤维细胞兼具普遍性和组织特异性特征。

Wnt5a⁺成纤维细胞和ncWnt信号在FD巩膜中显著下降

研究发现，簇11（Wnt5a⁺成纤维细胞）在FD处理24小时和48小时后比例显著下降。细胞通讯分析显示，Wnt5a⁺成纤维细胞主要通过胶原信号参与细胞间相互作用，是非经典Wnt（ncWnt）信号通路的主要配体来源。在FD眼中，ncWnt信号通路受到抑制。

RNA FISH验证Wnt5a⁺簇下降和免疫荧光标记显示FDM小鼠WNT5A减少

RNAscope分析发现，Wnt5a⁺成纤维细胞主要分布于后极部巩膜（特别是视乳头旁内层巩膜，iPPS），在FD眼中，其数量和Wnt5a斑点显著减少，呈现时空特异性下降模式。免疫荧光结果进一步证实，FD眼中后极部巩膜WNT5A蛋白水平降低。

shWnt5a-AAV注射诱导小鼠近视发展，siWnt5a转染抑制HSFs中Col1a1表达

巩膜下注射shWnt5a-AAV可特异性敲降巩膜Wnt5a表达，导致小鼠出现近视性屈光偏移和眼轴增长。巩膜胶原I（COL1A1）蛋白含量下降，胶原纤维直径变细。体外实验表明，WNT5A基因敲降通过非经典Wnt信号分子p-CaMK2A抑制COL1A1合成。

scleral AAV注射过表达Wnt5a抑制FDM但不影响正常屈光发育

Wnt5a过表达可抑制FDM发展，部分挽救FD引起的COL1A1蛋白水平下降，但对正常屈光发育无影响。这表明Wnt5a过表达 specifically counteracts FD-induced myopiagenesis without disrupting emmetropization.

shWnt5a-AAV注射小鼠巩膜bulk RNA-seq分析揭示Sparc是Wnt5a的关键下游靶基因

巩膜批量RNA-seq分析显示，shWnt5a-AAV注射眼ECM组织相关通路基因显著下调。加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）将Wnt5a归属于一个功能富集于ECM组织和自噬的基因模块，其中Sparc是核心枢纽基因。实验验证FD眼和shWnt5a-AAV注射眼巩膜SPARC蛋白水平下降。

shSparc-AAV巩膜下注射下调Collal基因表达并诱导小鼠近视

敲降Sparc可导致近视屈光偏移、眼轴增长、巩膜COL1A1水平下降及胶原纤维直径变细。体外实验证实siSPARC转染降低HSFs中COL1A1蛋白含量。这表明Sparc是Wnt5a下游调控ECM稳态和近视进展的关键效应分子。

抑制Wnt5a^hi成纤维细胞基因表达通过下调Wnt5a-CaMKII-ECM信号通路加剧近视进展

本研究构建了一个工作模型：异常视觉刺激通过视网膜-脉络膜-巩膜信号级联抑制Wnt5a^hi成纤维细胞的基因表达和WNT5A分泌，进而抑制非经典Wnt信号通路（Wnt5a-Ca²⁺-CaMKII），下调Colla1、Sparc等ECM分子基因表达，破坏ECM结构组织，降低胶原I水平和胶原纤维直径，最终导致巩膜ECM稳态失衡和近视进展。

研究结论与讨论部分指出，本研究首次在单细胞水平上揭示了巩膜成纤维细胞的显著异质性，并鉴定出一个独特的Wnt5a^hi成纤维细胞亚群。该细胞亚群的数量减少和功能抑制是近视发展中巩膜ECM稳态失衡的关键细胞来源。Wnt5a^hi成纤维细胞通过分泌WNT5A，以自分泌/旁分泌方式激活ncWnt信号通路，调控Sparc等下游靶基因，进而影响胶原合成、加工和组装，维持巩膜ECM稳态。该细胞亚群在后极部巩膜的特异性分布与近视病理改变的区域特征一致，进一步支持其关键作用。

此外，研究还发现Wnt5a^hi成纤维细胞高表达Cxcl5等炎症相关因子，提示其可能通过免疫炎症调节机制间接参与近视调控。这与既往研究中近视巩膜炎症因子升高的现象相吻合，为理解近视发病的免疫机制提供了新线索。

该研究的创新性在于：首次在单细胞分辨率下系统描绘了近视巩膜的细胞图谱；发现并功能验证了一个新的巩膜成纤维细胞功能亚群；阐明了Wnt5a-Sparc信号轴在近视巩膜ECM重塑中的核心作用；揭示了近视病理改变的细胞起源和分子机制。这些发现不仅深化了对近视发病机制的理解，而且将Wnt5a^hi成纤维细胞和Wnt5a信号通路确立为近视干预的潜在新靶点，为开发新的近视防治策略提供了重要理论基础和实验依据。