基于微流控-拉曼光谱联用的无培养临床病原体快速诊断新方法

《Nature Communications》：Rapid culture-free diagnosis of clinical pathogens via integrated microfluidic-Raman micro-spectroscopy

本研究针对抗菌素耐药性(AMR)这一全球健康挑战，开发了一种集成微流控富集、单细胞拉曼光谱和深度学习技术的无培养诊断平台。该平台可在20分钟内实现"样本到报告"检测，检测限低至<2 CFU/ml，在305例患者临床验证中与传统培养方法一致性达95.4%，为AMR防治提供了新一代快速诊断解决方案。

　　

抗菌素耐药性(AMR)已成为人类健康的主要威胁之一，全球范围内因AMR导致的死亡人数预计将从2019年的约500万上升至2050年的约1000万。这一危机的加速发展主要源于抗生素的过度使用和错误处方，而缺乏快速微生物感染诊断工具是重要原因。当前诊断金标准需要至少两天才能提供结果，包括冗长的样本培养(>24小时)和纯分离株病原体鉴定等步骤。在危急情况下，如败血症和肺炎，患者血液或肺积液中的细菌载量极低(1-100 CFU/ml)，每延迟一小时适当抗菌治疗，败血症患者生存率就会下降7.6%。

现有分子技术如PCR和全基因组测序(WGS)虽缩短了检测时间，但仍需DNA提取和富集，成本高且复杂。此外，核酸检测仅限于使用特定遗传标记识别已知物种，而宏基因组学虽能处理未培养样本，但需要高病原体载量，主要适用于有限样本类型。因此，快速、非靶向诊断早期感染和危及生命的病症，特别是那些病原体载量低的情况，仍然是未满足的临床需求。

拉曼光谱是一种无标记振动光谱技术，可在单细胞水平提供病原体的内在生化特征。每个单细胞拉曼光谱(SCRS)提供独特的"拉曼表型"，代表细胞生物分子的振动频率。尽管最近的研究证明了拉曼光谱在属、种甚至株水平识别病原体的潜力，但这些研究主要集中在分离株或加标临床样本的窄范围病原体上，在真实临床条件下的演示有限。

这项发表在《Nature Communications》上的研究开发了一种变革性的无培养方法，可在20分钟内实现微生物感染的快速"样本到结果"诊断。该平台结合了先进微流控技术、最大的病原体拉曼指纹数据库和深度学习算法，为临床诊断提供了全新解决方案。

研究采用了几项关键技术方法：创新的透析-介电泳(DEP)富集系统(AutoEnricher)可直接从临床样本中快速分离病原体；建立了包含342个临床分离株(29种细菌和7种真菌)的单细胞拉曼光谱数据库；开发了一维ResNet深度学习模型用于病原体识别；研究还纳入了来自两家医院的305例患者的多类型临床样本进行验证。

工程化微流控富集系统

研究人员开发了自动化、集成化的透析-DEP微流控系统，该系统集成了膜透析单元和DEP微流控装置。样本首先通过透析单元进行脱盐，电解质通过多孔膜扩散并被逆流的水去除，使样本电导率显著降低，为高效病原体捕获做好准备。脱盐后的样本进入DEP芯片，通过正介电泳(pDEP)力捕获病原体。该系统可处理毫升级样本，在<15分钟内选择性捕获病原体，其他样本成分被转移到废液出口，产生纯化和富集的病原体用于拉曼测量。

系统表征

系统表征显示，在40V电压下，流速为400μL/min时捕获效率>95%。对10种代表主要病原体群的物种进行测试，捕获效率在89.1%至99.5%之间，证明了系统对临床样本中未知病原体物种进行盲测的能力。

捕获极低细菌载量

使用浓度低至~2 CFU/ml的RFP大肠杆菌评估富集系统的捕获效率，结果显示捕获细胞数与理论输入细胞数在所有浓度下呈线性相关，平均梯度为0.84±0.06(R²>0.98)，表明系统对低至~2 CFU/ml浓度的病原体具有优异捕获能力。

建立拉曼鉴定数据库和分类模型

研究构建了包含342个临床分离株的单细胞鉴定数据库，涵盖36个临床重要物种，每个分离株包括300个SCRS，总计102,600个SCRS。通过无监督t-SNE将高维拉曼数据集投影到二维空间，显示不同病原物种具有明显的光谱差异。

ResNet模型训练

使用一维ResNet模型对342个临床分离株进行训练，通过分层组五折交叉验证，模型在物种水平上达到95.1%的平均准确率。27个物种的预测准确率为100%，表明模型基于拉曼光谱指纹区分这些病原体的强大能力。

临床验证

在305例患者的临床研究中，各种临床样本包括尿液、胆汁、脑脊液、引流液和穿刺液均通过无培养富集系统处理。该方法在20分钟内实现"样本到报告"检测，总准确率为95.4%(305例中的291例)，灵敏度为98.5%，特异性为83.6%。对120例阳性样本的拉曼鉴定显示，与培养/MALDI-TOF结果总体一致率为82.5%。

研究结论与意义

该研究提出了一种通过集成微流控富集系统、单细胞拉曼光谱和深度学习模型的临床微生物感染诊断的无培养变革性方法。该平台高效(<20分钟)、灵敏(<2 CFU/ml)、准确(对342个临床分离株物种水平达95.1%)且可扩展(在305例患者临床验证研究中验证)。

与现有诊断技术相比，该方法在非靶向检测未知病原体、短周转时间和低检测限方面提供了显著进步。其检测未知病原体的能力、短周转时间和低检测限与需要冗长样本制备的现有方法形成鲜明对比。微流控富集系统结合富集病原体的视觉检查以确定阳性或阴性感染，达到了98.5%的灵敏度和83.6%的特异性。

该研究的独特之处在于超越了实验室环境，进行了305例患者的大规模临床试验，以在真实世界环境中验证该方法。与传统培养方法相比，从临床样本中分类病原体的高准确性(总体82.6%，混合感染91.3%)强调了其作为有前景的快速诊断工具的有效性和准备度。

未来工作将聚焦于将微流控富集系统与AST程序和临床工作流程整合，进行更大规模的多中心试验，并评估其对患者结局的影响，这对于广泛采用至关重要。该方法简单易操作，无需培养或破坏性处理，提供20分钟内的快速"样本到报告"工作流程，满足了ICU和初级保健中快速识别细菌感染的紧急诊断需求。