PHYA顺式调控元件的趋同进化塑造两栖植物的水下逃逸能力

《Nature Communications》：A cis-regulatory element of the PHYTOCHROME A gene confers the submergence escape capacity for amphibious plants

本研究揭示了光受体PHYA通过其启动子区一个EIN3结合的(4/c)CAGCT顺式调控元件变异，负调控两栖植物水下茎秆伸长的新机制。通过比较两栖性空心莲子草与陆生刺花莲子草，发现该元件的存在使PHYA在淹水时被EIN3抑制表达，从而促进逃逸生长。该调控模块在多种两栖植物中保守存在，为植物二次水生适应的分子基础提供了新见解，并为通过顺式调控编辑培育抗涝作物提供了新策略。

　　

当洪水来袭，植物如何争分夺秒地向上生长以逃离水下困境？这不仅是自然界生存竞赛的精彩瞬间，更是植物适应性进化研究的核心问题。两栖植物作为水生与陆生环境之间的“跨界专家”，其特有的水下茎秆快速伸长能力，为解析植物应对淹水胁迫的分子机制提供了理想模型。然而，这种跨物种广泛存在的逃逸策略背后，是否存在共通的遗传密码？其精准的环境感知与生长调控网络又是如何运作的？这些问题一直困扰着研究者。

近日发表于《Nature Communications》的一项研究，通过比较两栖性空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）与其陆生近缘种刺花莲子草（A. pungens），揭示了光受体PHYTOCHROME A（PHYA）通过顺式调控元件的变异，介导物种特异性淹水逃逸能力的新机制。研究发现，PHYA作为淹水诱导伸长的负调控因子，其表达受到乙烯信号核心转录因子EIN3的直接抑制，而这一调控关系的建立，取决于PHYA启动子区一个关键顺式元件的存缺。更令人惊讶的是，该调控模块在多个远缘两栖植物中独立出现，为形态创新的趋同进化提供了分子证据。

研究主要整合了比较基因组学、转基因技术、蛋白免疫印迹、染色质免疫沉淀、双荧光素酶报告系统等技术手段。实验材料包括两种莲子草的自然种群、拟南芥phyA和ein3eil1突变体、水稻CRISPR/Cas9敲除株系，以及多种两栖植物与陆生近缘种的对比样本。

A. philoxeroides和A. pungens对淹水表现出不同的塑性响应

通过模拟不同水文条件处理，研究发现两栖性空心莲子草（Aph）在3天和6天淹水后，节间伸长程度（3天：2.65倍 vs 1.53倍；6天：3.89倍 vs 2.33倍）和叶绿素保留能力均显著高于陆生刺花莲子草（Apu），且活性氧积累更低，叶片结构损伤更轻。双向方差分析表明环境和物种背景均对表型有极显著影响，证实Aph具有更强的淹水逃逸可塑性。

PHYA介导A. philoxeroides和A. pungens之间不同的淹水响应

转录组分析显示，远红光受体PHYA在淹水条件下呈现物种特异性调控模式：ApuPHYA在淹水后快速显著诱导，而AphPHYA仅短暂轻微上调。免疫印迹证实Apu中PHYA蛋白积累更高，且在拟南芥中观察到类似调控模式。在Aph中过表达ApuPHYA-B2的转基因株系，表现出节间伸长受阻、ROS积累增加和叶绿素保留降低的Apu样表型，表明PHYA表达差异是种间表型分化的主要驱动力。

PHYA负调控淹水诱导的伸长生长

利用拟南芥phyA突变体（atphyA-211、atphyA-201、atphyA-202）证实，PHYA缺失突变体在淹水后叶柄伸长显著增强（Col-0 vs atphyA-211：1.84倍 vs 2.20倍），而过表达株系可回补该表型。在水稻中利用CRISPR-Cas9构建的osphyA突变体同样表现出淹水后节间伸长和株高增加，叶绿素保留更高。RNA-seq分析显示，PHYA与EIN3/EIL1共同调控4485个基因，这些基因显著富集于光信号、BR（油菜素内酯）响应、细胞壁组织等生长相关通路，表明PHYA通过抑制淹水诱导基因的表达负调控淹水响应。

AphPHYA和ApuPHYA在调控淹水诱导伸长生长中的功能保守性

序列分析显示Aph和Apu的PHYA旁系同源基因具有高度保守性（92.87%-99.55%），均包含光敏蛋白典型结构域和关键功能位点。在atphyA-211背景下过表达AphPHYA-B1或ApuPHYA-B2，均能回补突变体增强的叶柄伸长表型，并在荫蔽和远红光条件下恢复下胚轴伸长表型。qRT-PCR证实这两个转基因株系中淹水响应标记基因（AtRAP2.2、AtRAP2.3、AtEBF2、AtPIF3）的表达水平恢复至野生型水平，证明PHYA在物种间功能保守。

顺式调控基序(4/c)CAGCT介导AphPHYA启动子在淹水下的活性

启动子分析发现，AphPHYA的五个旁系同源基因均含有一个或两个(4/c)CAGCT基序（与拟南芥中EIN3介导的抑制相关），而ApuPHYA中完全缺失该基序。启动子-荧光素酶报告系统显示，缺失该基序的AphPHYA启动子（Pro_{AphPHYA-B1-Δ}::LUC）活性增加2.5倍，而插入该基序的ApuPHYA启动子（Pro_{ApuPHYA-B2-add}::LUC）活性降低44%。在Aph叶片中的瞬时转化和蛋白水平检测进一步证实，该基序缺失导致淹水诱导的PHYA蛋白积累显著增加，表明(4/c)CAGCT基序参与淹水下AphPHYA的转录抑制。

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EIN3通过(4/c)CAGCT基序调控PHYA表达

基于DAP-seq数据（GSE249660）和ChIP-PCR分析，发现AphEIN3在淹水后能直接结合AphPHYA-A3和AphPHYA-B1启动子，而ApuEIN3结合能力显著较低。双荧光素酶实验证实AphEIN3抑制AphPHYA转录。表型分析显示拟南芥atein3eil1突变体淹水后叶柄伸长显著减弱（2.05倍 vs 1.58倍），而过表达株系可回补表型，证实EIN3在淹水诱导生长中的正向作用。这种差异调控并非由EIN3转录水平差异引起，而是取决于启动子基序的存在与否。

(4/c)CAGCT基序在两栖植物PHYA启动子中的重现

对61种被子植物（17种两栖植物、8种浮水植物、8种沉水植物和28种陆生近缘种）的分析显示，虽然PHYA拷贝数无显著差异，但两栖植物PHYA启动子中(4/c)CAGCT基序出现频率显著高于陆生近缘种（4.3倍）。在不同科的代表物种对中验证了这一规律：两栖植物豆瓣菜（Nasturtium officinale）比陆生近缘种恩施碎米荠（Cardamine enshiensis）基序数量更多，PHYA蛋白诱导水平更低，逃逸表型（株高：2.15倍 vs 1.21倍；叶绿素保留：0.65倍 vs 0.09倍）更优。类似趋势在禾本科的两栖植物互花米草（Spartina alterniflora）、芦苇（Phragmites australis）与陆生近缘种结缕草（Zoysia japonica）、柳枝稷（Panicum virgatum）中也得到证实，表明该顺式调控模块与两栖植物淹水逃逸能力的趋同进化相关。

研究最终构建了一个完整的调控模型：在两栖植物中，PHYA启动子保留的(4/c)CAGCT基序使得EIN3在淹水条件下能够结合并抑制PHYA转录，解除PHYA对伸长生长的抑制作用，从而促进逃逸行为。而在陆生植物中，该基序的缺失导致PHYA在淹水时持续高表达，抑制逃逸可塑性。这种顺式调控元件的“周转”成为生态适应性进化的快速通道。

这项研究不仅首次揭示了PHYA在淹水应答中的核心作用，更重要的是阐明了顺式调控进化如何通过“分子工具包”的重复利用，驱动远缘物种形成相似适应性表型的机制。研究所发现的EIN3-PHYA调控模块，展现了植物如何整合光信号与内源激素信号以协调应激发育程序的精巧设计。从应用视角看，对关键顺式元件的识别为作物改良提供了新路径：通过精准编辑PHYA启动子，有望培育出在正常条件下保持株型、在涝害时启动伸长避害的“智能型”作物，为应对气候变化下的极端天气挑战提供解决方案。