膜嵌入人T细胞受体-CD3复合物的天然脂质环境构象动态与激活机制解析

《Nature Communications》：The resting and ligand-bound states of the membrane-embedded human T-cell receptor–CD3 complex

本研究针对T细胞受体（TCR）激活机制争议，通过冷冻电镜解析纳米盘嵌入的人TCR-CD3复合物在未结合和HLA结合状态的结构，发现其生理静息态为闭合紧凑构象，配体结合诱导开放延伸构象转变。构象锁定实验证实胞外域开放是T细胞最大激活的必要条件，揭示了脂质环境对膜蛋白结构决定的关键作用，为免疫治疗工程提供新思路。

　　

T细胞作为适应性免疫的核心执行者，其功能发挥依赖于T细胞受体（TCR）对抗原信号的精准识别。TCR与CD3蛋白形成异源八聚体复合物，通过识别抗原呈递细胞上的人类白细胞抗原（HLA）复合物来启动T细胞激活。然而令人困惑的是，尽管该复合物的组成已知数十年，其激活机制仍存在核心争议：究竟是配体结合直接诱发复合物构象变化，还是需要外力或聚集等外部因素驱动？

以往在去垢剂中解析的TCR-CD3结构显示，无论是否结合HLA，复合物均保持相似的开放延伸构象，这似乎否定了构象变化模型。但生物化学证据却提示脂质双分子层在TCR信号转导中扮演关键角色，去垢剂环境可能无法还原生理状态下的真实构象。这种矛盾使得领域内对TCR激活机制的认识陷入僵局。

为解决这一根本问题，Ryan Q. Notti团队在《Nature Communications》发表的研究中，创新性地将人TCR-CD3复合物重构至模拟天然脂质环境的纳米盘中，利用冷冻电镜解析了其静息态和配体结合态的高分辨率结构。研究首次揭示：在天然脂质环境中，未受刺激的TCR-CD3会采用两种相关的闭合紧凑构象（ND-I和ND-II），这与去垢剂中观察到的开放构象截然不同。而HLA配体结合后，复合物会发生显著的变构转变，恢复为开放延伸构象。通过工程二硫键锁定实验，研究进一步证实从闭合构象向开放构象的转变是T细胞最大激活的必要条件。

关键技术方法包括：采用BacMam表达系统在HEK293F细胞中表达1G4 TCR-CD3复合物；通过镍柱亲和纯化后，将复合物重构至含哺乳动物极性脂质和胆固醇琥珀酸酯的膜支架蛋白纳米盘中；利用单颗粒冷冻电镜解析未结合和HLA结合的复合物结构；通过工程二硫键交联和质谱分析验证体内构象；使用NFAT报告基因检测系统评估T细胞激活功能。

研究结果

全局结构揭示脂质环境诱导构象重排

在去垢剂GDN中解析的TCR-CD3结构与既往研究一致，呈现典型的开放延伸构象。而纳米盘嵌入的复合物则表现出显著不同的形态特征：沿膜法线方向缩短约35?，并形成新的结构域间接触。两种纳米盘结构（ND-I和ND-II）虽存在差异，但均呈现胞外域闭合和近膜连接肽压缩的特征，代表其生理静息态。

蛋白-脂质相互作用网络的发现

结构分析显示TCR-CD3与脂质双分子层存在广泛相互作用。两个胆固醇分子（Chol_A和Chol_B）以尾对尾方式嵌入CD3ζ、TCRα、TCRβ和CD3γ形成的沟槽中，且在紧凑构象中发生相对位移。多个位点发现未建模的管状密度，对应磷脂酰链与CD3跨膜螺旋的相互作用。尤其值得注意的是，CD3胞外域膜近端表面存在高度保守的静电中性区域，这些区域与脂质头基形成稳定接触，提示蛋白-脂质相互作用在维持静息态构象中的重要作用。

体内验证闭合构象为生理静息态

为确认纳米盘中观察到的闭合构象是否代表体内真实状态，研究团队设计了系列二硫键工程实验。选择在ND-I/II构象中Cα-Cα距离小于7?、而在GDN构象中大于7?的残基对，将其突变为半胱氨酸。免疫印迹和质谱分析结果显示，针对闭合构象设计的TCRα-CD38链间二硫键和TCRα/TCRβ链内二硫键均能在细胞内高效形成，而针对开放构象设计的二硫键则无法形成。这些数据强有力地证明闭合紧凑构象是TCR-CD3在体内的天然静息状态。

配体结合诱导构象变化的直接证据

将纳米盘嵌入的TCR-CD3与NY-ESO-1-HLA单链三聚体孵育后，冷冻电镜结构显示复合物转变为开放延伸构象，与去垢剂中的结构高度相似。与静息态相比，HLA结合后TCR可变域的结构刚性显著增强，多个在静息态中无序的环区变得有序。这一转变伴随着跨膜螺旋张角的减小和连接肽的延伸，为胞外信号向胞内免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）的传递提供了结构基础。

构象变化与T细胞激活的功能关联

通过构建构象锁定突变体（TCRα S104C-V182C），研究团队直接验证了构象变化的功能意义。尽管该突变体的表面表达和HLA结合能力与野生型相当，但其在HLA-抗原四聚体或肽脉冲细胞刺激下的NFAT报告基因激活水平显著降低（峰值激活减弱26%-42%）。而PMA/离子霉素的旁路激活则不受影响，表明缺陷特异于TCR-CD3信号通路。这证实从静息态向激活态的构象转变是配体依赖性T细胞激活的必要条件。

讨论与意义

本研究通过对比去垢剂与纳米盘环境中TCR-CD3的结构差异，确立了变构构象变化在TCR激活中的核心地位，解决了领域内长期存在的争议。研究发现脂质环境不仅稳定静息态构象，还通过保守表面斑块与CD3胞外域的相互作用，为构象转变提供能量屏障。构象依赖性的糖基化-糖基化相互作用网络的发现，提示糖基化修饰可能通过形成氢键网络调节TCR激活阈值。胆固醇分子的动态重排及其与膜脂质的交换通道的发现，为膜脂组成调控TCR功能提供了结构解释。

这些发现对免疫治疗领域具有深远影响：首先，证实天然脂质环境对膜蛋白结构研究的重要性，提示以往在去垢剂中获得的许多膜蛋白结构可能需要重新评估；其次，TCR构象动态的阐明为理性设计免疫疗法提供新靶点，例如通过调控构象平衡来增强CAR-T或TCR-T细胞的抗肿瘤活性；最后，个体间TCR恒定区或CD3蛋白的遗传变异可能通过影响构象景观来调控T细胞基线敏感性，这为个性化免疫治疗提供新思路。

该研究不仅深化了对TCR激活机制的理解，更开创了在近生理环境中研究免疫受体构象动态的新范式，为未来免疫治疗策略的开发奠定了坚实基础。