细胞特异性GJB2基因递送恢复DFNB1耳聋模型听力功能并在非人灵长类耳蜗中介导精准表达

《Nature Communications》：Cell-specific delivery of GJB2 restores auditory function in mouse models of DFNB1 deafness and mediates appropriate expression in NHP cochlea

本研究针对GJB2基因突变导致的DFNB1遗传性耳聋，通过ATAC-seq技术筛选基因调控元件(GREs)，构建AAV9-PHP.B载体介导的细胞特异性GJB2基因治疗系统。研究证实GREs可精准限制GJB2在耳蜗上皮细胞和纤维细胞中的表达，避免毛细胞和神经元的异位表达毒性，在Gjb2条件性敲除和小鼠模型中完全恢复听觉功能，并在食蟹猴耳蜗中验证其安全性和靶向特异性，为临床转化提供重要依据。

　　

当新生儿来到这个世界时，声音是他们感知环境的重要桥梁。然而，全球每千名新生儿中就有2-3名患有听力障碍，其中高达50%的先天性耳聋病例源于DFNB1——一种由GJB2基因突变导致的遗传性疾病。在美国，每年约有3500名儿童携带GJB2基因的双等位基因突变，其中三分之二在出生时尚存残余听力，但多数会在几年内完全丧失，这提示存在一个关键的治疗窗口期。

GJB2编码的连接蛋白26(connexin26)在耳蜗中形成复杂的间隙连接网络，分布于柯蒂氏器的支持细胞、内外沟上皮细胞、螺旋韧带纤维细胞等部位，但奇怪地缺席于感觉毛细胞和螺旋神经元。这种独特的分布模式暗示着精确的细胞特异性表达对听觉功能至关重要。此前，研究人员尝试通过腺相关病毒(AAV)载体进行GJB2基因替代治疗，但效果有限。问题在于：传统广谱启动子会导致GJB2在毛细胞和神经元中异位表达，可能通过电耦合干扰细胞正常电生理活动，甚至导致实验动物死亡。

为解决这一难题，哈佛医学院David P. Corey团队在《Nature Communications》发表了一项突破性研究。他们创新性地采用ATAC-seq(转座酶可及染色质测序)技术，从新生小鼠耳蜗中鉴定出可驱动细胞特异性表达的基因调控元件(GREs)，并构建了精准靶向的AAV基因治疗系统。该系统成功在小鼠模型中完全恢复听觉功能，并在非人灵长类动物中验证了其安全性和有效性。

关键技术方法包括：通过ATAC-seq从P2、P5、P8新生小鼠耳蜗中筛选Gjb2基因附近的调控元件；构建携带GREs的AAV9-PHP.B载体；使用Gjb2条件性敲除小鼠(Gjb2^Pf/Pf, Sox10-Cre)和Gjb2^Gjb6-小鼠模型；通过圆窗膜注射递送载体；采用听性脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)评估听觉功能；利用免疫荧光染色和扫描电镜分析耳蜗形态。

基因调控元件限制病毒GJB2表达

研究人员首先发现，使用广谱CBA启动子驱动GJB2表达会导致小鼠严重震颤和死亡，而携带35delG无效突变的对照载体则无此毒性，证实异位表达GJB2可能通过电耦合干扰神经元活动。通过ATAC-seq分析，团队鉴定出Gjb2基因附近数十个开放染色质区域，最终选择包含假定启动子的非编码外显子1区域(GRE1)和3'非编码区(GRE2)构建载体。

毛细胞和支持细胞在条件性敲除小鼠中退化导致严重耳聋

在Gjb2^Pf/Pf, Cre+条件性敲除小鼠中，P6时耳蜗器官中GJB2网络完全缺失，但毛细胞形态正常。至P30时，毛细胞和支持细胞出现明显退化，感觉上皮变平，ABR阈值高达120dB以上，表现为全聋。

携带GREs的病毒递送GJB2挽救敲除小鼠的耳蜗形态和听力

注射AAV-GRE-mmGJB2.HA可防止Gjb2^Pf/Pf, Cre+小鼠在P30时出现典型的耳蜗退化，毛细胞得以保留，但听觉功能仅改善10-15dB。而注射无HA标签的AAV-GRE-hsGJB2可完全恢复GJB2网络，ABR阈值改善约50dB，但DPOAE无改善，提示外毛细胞功能未完全恢复。

AAV介导的GJB2表达在轻度DFNB1小鼠模型中保护耳蜗结构

在Gjb2^Gjb6-小鼠模型中，GJB2蛋白水平降低但未完全缺失。注射AAV-GRE-hsGJB2.HA虽能表达GJB2，但导致耳蜗结构异常，包括中阶体积减少、盖膜增厚、外毛细胞丢失。而无HA标签的GJB2可完全恢复耳蜗结构和毛发束形态。

AAV-GRE-hsGJB2挽救Gjb2Gjb6-小鼠的听力

Gjb2^Gjb6-小鼠在P30时表现为全聋，注射无HA标签的AAV-GRE-hsGJB2后，高、中、低剂量组均实现ABR反应的完全恢复，效果持续至P90。DPOAE测量显示所有剂量组均实现强劲挽救，高水平维持至P90。

GREs在NHP耳蜗中介导的GJB2表达与小鼠相似

在食蟹猴耳蜗中，内源性GJB2表达模式与小鼠相似，分布于上皮和结缔组织细胞，但毛细胞中缺失。AAV-CBA-eGFP载体产生广泛表达，而AAV-GRE-hsGJB2.HA介导的表达则精准靶向GJB2表达细胞，避免毛细胞转导。

AAV-GRE-hsGJB2.HA在NHP耳蜗中安全性良好

组织学分析显示，AAV处理组耳蜗组织形态结构正常，无显著异常。IBA1染色证实无免疫细胞浸润，听觉测试表明载体注射未导致听力阈值显著变化。

这项研究通过创新性的基因调控元件设计，实现了GJB2在耳蜗中的细胞特异性表达，解决了以往基因治疗中异位表达导致的毒性问题。研究不仅在小鼠模型中实现了听觉功能的完全恢复，还在非人灵长类动物中验证了其安全性和靶向特异性，为DFNB1耳聋的临床基因治疗奠定了坚实基础。该策略的成功也为其他需要细胞特异性表达的基因治疗方法提供了重要借鉴。

研究还揭示了GJB2在听觉系统中的复杂功能：在发育早期对耳蜗隧道形成至关重要，在支持细胞中参与钾离子循环，在血管纹中参与内淋巴电位产生。不同细胞类型和发育阶段对GJB2的需求差异，解释了为何在严重突变模型中挽救效果有限，而在轻度模型中可实现完全恢复。这些发现深化了我们对连接蛋白26在听觉系统中功能多样性的理解，为精准医疗提供了新视角。