mRNA-LNP疫苗通过I型干扰素和Ebi2-氧固醇轴协同增强生发中心反应的机制研究

《Cell》：Distinct components of mRNA vaccines cooperate to instruct efficient germinal center responses

本文揭示了mRNA-LNP疫苗中核苷修饰的mRNA和脂质纳米颗粒（LNP）组分通过协同激活I型干扰素（IFN-α/β）和Ebi2-氧固醇（7α,25-HC）轴，分别驱动树突状细胞（DC）的成熟、抗原呈递以及促进滤泡辅助性T细胞（Tfh）分化，从而共同放大生发中心（GC）B细胞反应和体液免疫，为优化mRNA疫苗设计提供了关键理论基础。

　　

Type I IFNs driven by nucleoside-modified mRNA amplify GC reactions

研究表明，核苷修饰的mRNA-LNP疫苗能够驱动I型干扰素（IFN-α和IFN-β）的产生，这些细胞因子对于优化生发中心（GC）反应至关重要。通过使用IFN受体1（IFNAR）阻断抗体或条件性敲除小鼠（Cd11c-cre Ifnar^flox/flox），发现阻断IFNAR信号会显著削弱由Spikevax（Moderna COVID-19 mRNA疫苗）或定制HA mRNA-LNP疫苗诱导的Tfh细胞和GC B细胞反应。进一步分析显示，疫苗接种后8小时，引流淋巴结（dLN）、血清和注射部位可检测到IFN-α和IFN-β的峰值表达。重要的是，这种由mRNA驱动的I型IFN信号对于树突状细胞（DC）的成熟（表现为CD80和CD86表达上调）和有效的抗原呈递至关重要，从而放大了GC反应。

IRF3/IRF7 regulate type I IFN-dependent GC responses to mRNA-LNP

研究探讨了I型IFN产生的上游信号通路。虽然髓样分化因子88（MyD88）对于Spikevax诱导的GC反应是必需的，但使用报告细胞系和基因缺陷小鼠进行的实验排除了Toll样受体7（TLR7）、TLR4、TLR2、TLR3、RIG-I、MDA5/MAVS通路以及STING在感知测试的mRNA-LNP疫苗配方中的直接作用。然而，Irf3-Irf7双敲除小鼠完全抑制了疫苗接种后的IFN-α产生，并废除了GC反应，表明IRF3/IRF7是mRNA疫苗诱导I型IFN和GC反应的关键调节因子。此外，白细胞介素-1受体（IL-1R）的阻断（而非IL-18阻断）也损害了GC反应，但这种效应不依赖于I型IFN，提示IL-1/MyD88轴以I型IFN非依赖的方式调节mRNA疫苗接种中的Tfh细胞分化。

The nucleoside-modified mRNA influences Tfh cell function and enhances B cell responses

为了区分mRNA和LNP组分的各自作用，研究比较了重组HA蛋白混合空载LNP（rHA+eLNP）与重组HA蛋白混合含有编码荧光素酶的核苷修饰mRNA的LNP（rHA+Luc mRNA-LNP）的免疫效果。虽然总Tfh细胞反应相似，但含有核苷修饰mRNA的免疫原驱动了更高比例的产生IFN-γ和IL-21的Tfh细胞。功能上，这转化为更强大的抗原特异性记忆B细胞（MBC）、抗体分泌细胞（ASC）反应，以及更高的血清HA特异性IgG（特别是IgG2c亚型）滴度和中和抗体效价。这表明核苷修饰的mRNA不仅增强反应强度，还调节Tfh细胞的功能状态，从而优化B细胞应答的质量。

LNPs instruct distinct transcriptional states in DCs

利用LIPSTIC（通过sortagging标记细胞间接触）系统追踪抗原呈递DC，并通过单细胞RNA测序分析其转录谱。主成分分析（PCA）显示，LNP的存在是驱动DC转录组变异的主要因素。与使用AddaVax佐剂的蛋白疫苗相比，LNP佐剂的疫苗（无论是否含有mRNA）显著上调了DC的激活标志物（如CD80、CD86）、T细胞启动和迁移/趋化相关基因的表达。值得注意的是，LNP驱动了cDC2s中Il2ra（编码CD25）和Gpr183（编码Ebi2）的表达，这两种分子已知在促进Tfh细胞命运中发挥重要作用。

LNPs induce a pro-Tfh cell program in cDC2s and guide Tfh cell differentiation via an Ebi2-oxysterol axis

深入分析发现，LNP佐剂疫苗诱导的cDC2s高表达CD25（IL-2Rα），其可溶性形式（sCD25）可以淬灭IL-2，从而解除对Tfh细胞分化的抑制。在Cd11c-cre il2ra^flox/flox小鼠（DC特异性缺失CD25）中，Spikevax免疫后的Tfh和GC B细胞反应受损，证实了DC来源的CD25的重要性。同时，LNP注射上调了胆固醇25-羟化酶（Ch25h）和细胞色素P450家族7亚家族B成员1（Cyp7b1）的表达，这两个酶负责产生Ebi2的配体7α, 25-二羟基胆固醇（7α,25-HC）。体外迁移实验证实LNP注射后dLN脂质提取物中Ebi2配体活性增加。更重要的是，Ch25h^-/-小鼠在mRNA-LNP免疫后表现出Tfh细胞反应缺陷，表明LNP驱动的7α,25-HC产生对于有效的GC反应至关重要。

Conventional DCs efficiently internalize mRNA-LNP

通过使用DiI标记LNP和EGFP编码mRNA的疫苗，研究追踪了体内DC对mRNA-LNP的摄取和加工。所有DC亚型（cDC1, cDC2, LC）都能不同程度地结合/内化LNP并表达mRNA编码的蛋白，其中cDC2s是最快且最有效的处理器。直接结合/内化了LNP的DiI⁺cDC2s表现出更高的CD25和Cxcr5表达，表明LNP的效应主要局限于直接接触它们的细胞。人源PBMC的体外实验也证实，人cDC1和cDC2能够有效内化mRNA-LNP。

mRNA-LNP uptake by cDCs takes place predominantly in dLNs

使用KikGR光转化系统追踪细胞迁移的研究挑战了传统观点。实验发现，在dLN中绝大多数能够表达mRNA编码蛋白（Thy1.1⁺）的DCs在免疫时已经位于淋巴结内（光转化标记为RFP⁺），而非从肌肉迁移而来。当在免疫前光转化dLN时，大多数Thy1.1⁺DCs是RFP⁺，且其中cDC2s的比例更高。这表明mRNA-LNP主要通过淋巴管到达dLN，并被淋巴结驻留的DCs（尤其是cDC2s）原位捕获和处理，而非依赖于肌肉中DCs的迁移。

LNP-adjuvanted responses occur in the dLNs

最后，实验证明LNP的佐剂活性是局部性的。当rHA和eLNPs分别注射到小鼠的对侧腿部时，在引流rHA注射部位的淋巴结中未检测到GC反应。而当eLNPs先于rHA 1小时在同一部位注射时，仍能引发强劲（虽略有减弱）的GC反应。这表明即使在高剂量下，LNPs也主要在疫苗注射的局部dLNs中发挥其佐剂活性，而非作为系统性佐剂。

综上所述，该研究阐明了mRNA-LNP疫苗强大的免疫原性源于其两个核心组分的协同作用：核苷修饰的mRNA通过IRF3/7依赖的途径诱导I型IFN，放大DC的激活和抗原呈递；而LNP则通过诱导DC表达CD25和驱动Ebi2/7α,25-HC轴，共同为Tfh细胞的分化和GC反应创造有利的微环境。这些发现深化了对mRNA疫苗作用机制的理解，为未来合理设计更有效的mRNA疫苗提供了重要的理论基础。