黑色素瘤细胞通过HLA外排诱骗细胞毒性T细胞促进免疫逃逸的新机制

《Cell》：HLA export by melanoma cells decoys cytotoxic T cells to promote immune evasion

本研究揭示了黑色素瘤免疫逃逸的新机制：黑色素瘤细胞分泌的黑色素瘤小体（melanosomes）表面携带MHC-I/ HLA分子，能够直接与CD8+T细胞的TCR结合，通过竞争性抑制T细胞与肿瘤细胞的直接相互作用，诱导T细胞功能失调和凋亡。该发现为改善黑色素瘤免疫治疗疗效提供了新的靶点。

　　

黑色素瘤是最致命的皮肤癌，尽管免疫检查点抑制剂等免疫疗法改变了其治疗格局，但约50%的患者对治疗无反应。这种耐药性的背后机制尚未完全阐明。一个令人困惑的现象是，黑色素瘤细胞通常表达高负荷的突变蛋白，能够被T细胞识别，然而肿瘤内浸润的活性T细胞却很少能产生根除肿瘤的免疫力。这提示肿瘤微环境中存在有效的免疫逃逸机制。传统研究多聚焦于肿瘤细胞自身的免疫抑制分子，而近年来，细胞外囊泡作为细胞间通讯的重要媒介，在肿瘤免疫调节中的作用日益受到关注。其中，外泌体（exosomes）的研究较为深入，但黑色素瘤细胞特有的、体积更大的细胞外囊泡——黑色素小体（melanosomes）在免疫调节中的作用却鲜为人知。黑色素小体是黑色素细胞谱系特有的细胞器，主要负责黑色素的合成和运输，以保护皮肤细胞免受紫外线损伤。此前的研究表明，黑色素瘤来源的黑色素小体在肿瘤进展中扮演多重角色，包括驱动成纤维细胞转化、促进淋巴管生成、诱导巨噬细胞异质化和导致化疗耐药。临床观察也发现，活跃的黑色素生成与患者较差的生存率相关。然而，黑色素小体是否以及如何直接调控T细胞功能，从而帮助黑色素瘤逃避免疫系统的攻击，是一个悬而未决的关键科学问题。

为了回答这个问题，研究人员开展了一项综合性的研究，结合多组学分析、细胞生物学实验、动物模型和临床样本验证，深入探究了黑色素小体在黑色素瘤免疫逃逸中的功能和机制。研究发现，黑色素瘤细胞通过分泌表面携带主要组织相容性复合物I类（MHC-I，在人类中为HLA）分子的黑色素小体，作为一种“诱饵”，直接与浸润的CD8⁺T细胞相互作用。这种相互作用不仅竞争性地耗竭了能够识别肿瘤抗原的T细胞克隆，还向T细胞传递了不完全的激活信号，导致其线粒体功能受损，最终走向凋亡。抑制黑色素小体的分泌则能显著增强CD8⁺T细胞的肿瘤浸润能力并抑制肿瘤生长。这项研究发表于顶级期刊《Cell》，揭示了一种前所未见的肿瘤免疫逃逸机制，为克服黑色素瘤免疫治疗耐药性提供了新的理论和策略依据。

本研究运用了多种关键技术方法。在样本来源上，研究使用了来自患者的黑色素瘤组织样本（包括石蜡包埋组织微阵列和新鲜活检组织）、患者来源的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和自体黑色素瘤细胞系，以及多种小鼠模型（包括C57BL/6J野生型、gp-100转基因和OT-1转基因小鼠）。关键技术包括：黑色素小体和外泌体的分离与鉴定（采用差速离心法和纳米颗粒跟踪分析技术NTA）、免疫肽组学分析（通过MHC-I免疫共沉淀结合液相色谱-串联质谱LC-MS/MS技术，系统鉴定黑色素小体和肿瘤细胞表面呈递的抗原肽）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序（scTCR-seq）（用于分析TILs的转录组状态和T细胞受体库）、高分辨率成像技术（如透射电子显微镜TEM、扫描电子显微镜SEM、ImageStream成像流式细胞术和共聚焦显微镜）以及体内功能验证实验（通过药物干预和CRISPR-Cas9基因敲除技术抑制黑色素小体分泌，观察其对肿瘤生长和免疫细胞浸润的影响）。

研究结果

黑色素小体的存在与不良预后、免疫治疗无应答及T细胞毒性降低相关

研究人员首先通过对癌症基因组图谱（TCGA）数据的分析发现，黑色素小体相关基因标签的表达与黑色素瘤患者的复发和生存率呈负相关。对已发表的转录组数据分析进一步揭示，对免疫检查点抑制剂有应答的患者，其黑色素生成和黑色素小体相关过程显著下调。对69例转移性黑色素瘤患者样本的分析显示，免疫治疗无应答者的T细胞负载了更多的色素，且这些T细胞体积更小，符合T细胞耗竭的特征。空间蛋白质组学数据也支持黑色素小体标记物Melan-A的表达与TIM3⁺耗竭T细胞的增加相关。功能实验表明，从患者样本中分离的黑色素小体能够与自体TILs结合，尤其是在无应答者中结合率更高。这种结合在30分钟内即可发生并保持稳定。更重要的是，预先暴露于黑色素小体的TILs在与其自体黑色素瘤细胞共培养时，其分泌干扰素-γ（IFN-γ）和颗粒酶B（Granzyme B）的能力显著降低，对黑色素瘤细胞的杀伤作用也减弱。在小鼠模型中，来自B16-F10黑色素瘤细胞的黑色素小体同样能抑制抗原特异性CD8⁺T细胞（来自gp-100或OT-1小鼠）的细胞毒性功能。

抑制黑色素瘤细胞的黑色素小体分泌可阻断肿瘤进展并诱导CD8⁺T细胞浸润

为了验证黑色素小体的功能，研究人员使用曲酸（kojic acid）——一种通过抑制酪氨酸酶（tyrosinase）来减少黑色素生成和黑色素小体分泌的化合物——来处理荷瘤小鼠。曲酸处理显著降低了肿瘤的色素沉着和黑色素小体分泌，但不影响黑色素瘤细胞自身的增殖或MHC-I的表达，也不直接影响CD8⁺T细胞的存活。在B16-F10-luciferase小鼠黑色素瘤模型中，瘤内注射曲酸显著抑制了肿瘤生长，延长了小鼠生存期，并伴随着肿瘤内CD8⁺T细胞浸润的显著增加。通过质谱流式细胞术（CyTOF）对肿瘤浸润免疫细胞进行深入分析发现，曲酸处理主要增加了细胞毒性CD8⁺T细胞和自然杀伤（NK）细胞的比例，并使CD4⁺T细胞向Th1表型偏移，而对髓系细胞群则无显著影响。重要的是，当使用抗CD8α抗体清除CD8⁺T细胞后，曲酸的抗肿瘤效应被大幅削弱。此外，在非黑色素瘤模型（MC38）中，曲酸处理对肿瘤生长没有影响，表明其作用是黑色素瘤特异性的。通过CRISPR-Cas9技术敲除B16-F10细胞中的酪氨酸酶基因，同样能模拟曲酸处理的效果，抑制肿瘤生长并增强CD8⁺T细胞浸润，进一步证实了黑色素小体分泌在免疫逃逸中的关键作用。

黑色素小体膜上的MHC-I类分子与CD8⁺T细胞上的TCR结合

机制探索始于对黑色素小体组成的分析。蛋白质组学分析显示，与外泌体相比，黑色素小体富含免疫相关蛋白，特别是与T细胞信号传导和MHC-I类抗原呈递相关的膜蛋白。重要的是，MHC-I抗原呈递通路仅在黑色素瘤来源的黑色素小体中富集，而在正常黑色素细胞来源的黑色素小体中缺失。流式细胞术和免疫电镜结果证实，黑色素瘤细胞及其分泌的黑色素小体表面均表达MHC-I/HLA分子，且这些分子能够正确负载抗原肽（如模型抗原卵清蛋白OVA_257-264）。当将负载OVA抗原肽的黑色素小体与OT-1小鼠（其TCR特异性识别OVA_257-264/H-2K^b复合物）的CD8⁺T细胞共培养时，电子显微镜观察到了膜-膜接触，类似于免疫突触的结构。成像流式细胞术分析进一步表明，抗原特异性的黑色素小体主要与CD8⁺T细胞膜共定位，而非被细胞内化；而缺乏相应抗原的黑色素小体或对照成纤维细胞则没有这种特异性结合。使用MHC-I缺陷的黑色素瘤细胞来源的黑色素小体进行实验，发现其与抗原特异性T细胞的结合能力显著减弱。这些证据共同表明，黑色素小体通过其表面的MHC-I/肽复合物与CD8⁺T细胞上的TCR进行特异性结合。

人类黑色素瘤黑色素小体MHC免疫肽组学分析揭示其携带TAA和新抗原

为了深入理解黑色素小体所呈递的抗原谱，研究人员对人类黑色素瘤细胞（WM3526）及其分泌的黑色素小体进行了免疫肽组学分析。结果显示，黑色素小体所呈递的MHC-I结合肽在长度分布、保留时间与疏水性关系等方面与亲本细胞表面的肽段特征相似。然而，与细胞样本相比，黑色素小体来源的肽段具有更高的预测MHC结合亲和力和疏水性，这些特征通常与增加的免疫原性潜力相关。虽然黑色素瘤细胞和黑色素小体的MHC-I配体组谱存在差异，但黑色素小体中绝大部分（83.8%）的肽段 repertoire 与亲本细胞重叠，表明其源自细胞总的配体组。通路富集分析显示，细胞和其黑色素小体在功能类别上存在显著重叠，如MHC-I介导的抗原加工和呈递、DNA修复和细胞周期调控等。更重要的是，研究在黑色素小体样本中鉴定出25个肿瘤相关抗原（TAA），其中大部分也能在相应的黑色素瘤细胞样本中检测到，且黑色素小体在TAA呈递方面显著富集。此外，通过全外显子测序和蛋白质组学分析，还鉴定出三个突变来源的新抗原（neoantigens），其中两个同样存在于细胞MHC-I库中。这些发现表明，黑色素小体通过携带免疫原性肽段（包括TAA和新抗原），与黑色素瘤细胞竞争CD8⁺T细胞的识别。

大多数与黑色素小体结合的CD8⁺TILs的TCR与黑色素瘤结合的CD8⁺TILs共享

为了在克隆水平上阐明黑色素小体与T细胞的相互作用机制，研究人员从患者样本中分离并标记了分泌的黑色素小体及其来源的黑色素瘤细胞，将它们与自体T细胞共培养后，通过流式细胞分选技术分离出黑色素小体结合的、黑色素瘤结合的以及游离的CD8⁺TILs，并进行了单细胞TCR测序。对每位患者的分析显示，结合黑色素小体的CD8⁺TILs与结合黑色素瘤细胞的CD8⁺TILs之间存在共享的TCR克隆。虽然黑色素小体结合的TILs也包含独特的TCR，但共享克隆和黑色素瘤独特的克隆代表了扩增最显著的群体。值得注意的是，在无应答者中，黑色素瘤独特TCR克隆的比例远低于应答者（约4% vs. 约25%）。单细胞RNA测序分析显示，这些共享TCR克隆的TILs没有表现出强烈的偏向于某一种特定的转录状态。这些发现表明，黑色素小体和黑色素瘤细胞共享高度重叠的肽段库来结合CD8⁺TILs，提示黑色素小体通过与黑色素瘤细胞竞争TIL结合，充当了T细胞与肿瘤细胞之间的物理屏障。

黑色素小体与CD8⁺T细胞的结合诱导非最优转录谱、降低TCR信号和线粒体活性并导致凋亡

最后，研究人员探讨了黑色素小体结合对CD8⁺T细胞功能的直接影响。转录组学分析发现，经黑色素小体处理的TILs上调了颗粒酶家族基因和线粒体相关基因的mRNA水平，但同时其TCR下游信号通路的特征评分显著降低。尽管这些TILs产生了略多的IFN-γ mRNA，但并未伴随IFN-γ蛋白的分泌增加，且ZAP70磷酸化（TCR激活的标志）在黑色素小体相互作用后缺失。线粒体功能测定显示，黑色素小体处理后的CD8⁺T细胞线粒体活性显著降低。这种混合的T细胞状态——即部分激活基因上调但关键激活信号缺失和代谢功能受损——最终导致了CD8⁺T细胞的凋亡。因此，黑色素小体的结合重塑了TIL的转录谱，创造了一种“混乱”的状态，其特征是TCR信号传导减弱、线粒体活性降低和凋亡增加。

研究结论与意义

本研究首次系统地揭示了黑色素瘤细胞通过分泌大型细胞外囊泡——黑色素小体，进行免疫逃逸的一种新颖机制。该机制的核心在于，黑色素小体表面装饰有功能性的MHC-I分子，这些分子负载着高亲和力、高免疫原性的肿瘤抗原（包括TAA和新抗原）。它们能够像“诱饵”或“海绵”一样，在肿瘤微环境中与肿瘤细胞竞争性地结合抗原特异性CD8⁺T细胞。这种结合并非导致完全的T细胞激活，而是传递了不完整的激活信号（仅有TCR信号，缺乏共刺激信号），最终引发T细胞线粒体功能障碍、能量代谢受损和凋亡。因此，原本可以攻击肿瘤的T细胞在被黑色素小体“欺骗”后，不仅无法有效杀伤肿瘤，反而自身走向功能衰竭和死亡。

这项研究的发现具有重要的理论和临床意义。在理论层面，它拓展了我们对肿瘤免疫逃逸机制的认识，将细胞外囊泡的免疫调节作用从以往关注的外泌体延伸至谱系特异性的大囊泡——黑色素小体，并揭示了其直接通过抗原特异性方式干扰T细胞功能的全新路径。在临床层面，该研究为理解黑色素瘤免疫治疗耐药性提供了新的视角。研究结果表明，黑色素小体的水平可能与免疫治疗疗效相关，其可作为预测生物标志物。更重要的是，靶向黑色素小体的生物合成或分泌途径（例如使用曲酸或其衍生物），可能成为一种新的辅助治疗策略，旨在解除肿瘤微环境的这种免疫抑制屏障，从而增强现有免疫疗法（如免疫检查点阻断或过继性T细胞疗法）的疗效。尽管研究还存在一些局限性，如所鉴定新抗原的功能尚未验证、黑色素小体MHC分子的确切来源尚不清楚等，但无疑为未来开发新的黑色素瘤联合免疫治疗方案开辟了富有前景的方向。