对亲和力和间隔物设计的微调能够提升 DLL3 和 BCMA CAR T 细胞的活性

《mAbs》：Fine-tuning affinity and spacer design enhances T cell potency in DLL3 and BCMA CAR T cells

本研究评估了靶向BCMA和DLL3的CAR-T细胞设计中抗原结合亲和力和间隔器长度的影响。通过体外实验和肿瘤球体刺激实验发现，高亲和力（>100nM KD）结合中等长度间隔器（IgG1 Fc）的CAR设计可增强细胞功能，提高肿瘤杀伤和炎症因子分泌，为实体瘤治疗提供新策略。

　　
CAR-T细胞疗法在血液肿瘤中已取得显著突破，但其在实体瘤治疗中的应用仍面临挑战。本研究通过系统评估抗原结合亲和力与免疫受体间距两个核心设计参数，揭示了优化CAR-T细胞功能的关键机制。实验采用BCMA和DLL3两种肿瘤抗原，构建了涵盖不同亲和力（181 pM至407 nM）和间距长度（45AA、230AA、460AA）的复合型CAR-T细胞体系，结合体外功能实验和三维肿瘤球体模型，全面解析了设计参数与临床疗效的关联性。

在抗原结合特性方面，研究团队通过表面等离子共振（SPR）和流式细胞术证实，BCMA抗原亲和力阈值位于10-100 nM区间，超过该范围的设计能激活稳定的细胞毒性反应。DLL3抗原的亲和力阈值则略高于BCMA，约100-200 nM区间存在最佳功能窗口。值得注意的是，当亲和力低于100 nM时，无论靶点如何，CAR-T细胞的增殖能力和促炎因子分泌均出现显著衰减，这与现有临床数据中低表达率CAR-T疗法失败案例高度吻合。

关于间距设计，IgG1类间距（230AA）在两种靶点系统中均展现出最优性能。实验发现，短间距（CD8）虽能增强细胞表面受体聚集，但导致信号通路过度激活，在72小时急性毒性测试中表现为细胞存活率下降12%-18%。而长间距（460AA）虽能降低细胞毒性，但受体介导的信号转导效率降低约30%，导致肿瘤细胞清除率不足。这种矛盾效应提示存在最佳间距长度范围，IgG1类间距在维持稳定受体聚集的同时，通过优化膜蛋白间距平衡了信号强度与毒性风险。

在功能验证方面，研究构建了包含三重验证体系的评估模型：首先通过 Jurkat报告细胞系（NF-κB/GFP）定量检测CAR介导的信号通路激活程度，发现中等间距的CAR能产生持续48小时以上的信号应答；其次利用肿瘤球体模型进行持续10天的功能评估，证实高亲和力（KD<100nM）与中等间距的复合型CAR可使肿瘤抑制率达到85%以上，显著优于其他组合；最后通过单细胞测序分析显示，优化设计的CAR-T细胞在靶细胞结合后仍能保持42%的存活率，其细胞周期停滞于G1/S期转换点，证实了设计参数对细胞功能调控的精准性。

研究进一步揭示了靶点抗原的空间构象对间距设计的依赖性。BCMA抗原的完整胞外结构域（54AA）具有明确的膜近端定位特征，因此短间距（CD8）能更高效地形成稳定的免疫突触结构。而DLL3抗原的靶点区域位于N端DSL结构域（466AA总长度），其膜表面暴露程度较低，因此中等间距的IgG1类结构能有效缩短抗原-受体作用距离，同时保持足够的受体自由度进行构象调整。这种靶点特异性适配机制解释了为何同一间距设计在不同靶点系统中表现差异显著。

在临床转化层面，研究提出"双阈值优化"设计原则：亲和力阈值需根据靶点表达水平动态调整，当抗原表达量低于5×10^3 cells/cm2时，建议采用KD<50nM的中高亲和力设计；而当抗原表达量高于1×10^5 cells/cm2时，可安全使用KD<100nM的亲和力参数。间距选择则需结合靶点构象特征，对于膜表面延伸型抗原（如BCMA）推荐45AA短间距，而对于膜内陷型抗原（如DLL3）则建议230AA中等间距。

该研究对CAR-T细胞疗法的工程化具有重要指导意义。通过建立包含SPR亲和力测定、流式细胞术信号转导分析、肿瘤球体三维模型和长期功能评估的多维度验证体系，首次在统一平台上量化了设计参数对临床疗效的量化影响。特别在安全性评估方面，创新性地引入细胞周期分析模块，发现优化设计的CAR-T细胞在激活后仍能维持稳定的G0/G1期分布，这为解决CAR-T细胞治疗中的长期细胞毒性问题提供了新思路。

未来研究方向建议从三个维度拓展：首先建立动态靶点表达量与设计参数的关联模型，解决不同患者个体差异问题；其次开发基于机器学习的间距构象预测系统，通过计算机模拟减少动物实验依赖；最后构建类器官模型进行体内疗效预测，这需要整合单细胞测序数据和器官微环境参数。值得关注的是，研究在材料与方法部分披露的 proprietary RSV和HIV pseudoviral包装系统，若能公开其核心组件（如包膜蛋白序列和慢病毒载体元件），将显著提升CAR-T疗法的标准化进程。

本研究为实体瘤CAR-T疗法提供了关键设计参数：当靶点抗原表达量在5×10^3-5×10^5 cells/cm2范围内时，采用KD<100nM的高效结合型CAR设计，配合230AA的IgG1间距，可同时实现92%以上的肿瘤细胞清除率和85%以上的T细胞存活率。这一设计框架已在两种不同类型的实体瘤模型（B细胞恶性肿瘤和神经内分泌肿瘤）中验证，提示其具有跨适应症的应用潜力。特别是在DLL3靶点系统中，优化设计的CAR-T细胞展现出41%的长期内存细胞比例，这为克服实体瘤治疗中的免疫逃逸提供了新策略。