基于便携式长读长测序平台的MGMT启动子甲基化分析及其在胶质母细胞瘤预后评估中的临床应用研究

《Neuro-Oncology Advances》：10223-MPC-4Methylation Analysis of MGMT promoter Using a Bench-Top Long-Read Sequencer

本研究针对胶质母细胞瘤(GBM)患者对替莫唑胺(TMZ)化疗敏感性差异的临床难题，创新性地采用便携式纳米孔长读长测序技术对MGMT启动子甲基化状态进行分析。通过对3例GBM样本进行扩增子测序，成功实现16个CpG位点的甲基化精准检测，其结果与焦磷酸测序高度一致。该研究为MGMT甲基化检测提供了新型快速诊断方案，对神经肿瘤个体化治疗具有重要转化价值。

　　

在神经肿瘤领域，胶质母细胞瘤(GBM)作为最具侵袭性的脑恶性肿瘤，其标准治疗方案——替莫唑胺(TMZ)同步放化疗联合辅助化疗——的疗效存在显著个体差异。这种差异的关键调控因子MGMT(O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)DNA修复酶的活性，受到其启动子区域CpG岛甲基化状态的精确调控。当MGMT启动子发生高甲基化时，基因表达沉默可增强肿瘤对TMZ的敏感性；反之，低甲基化状态则导致治疗抵抗。目前临床常用的焦磷酸测序技术虽能提供定量检测，但操作流程复杂、耗时较长，亟需开发更高效的甲基化检测新方法。

近年来，纳米孔长读长测序技术的突破性进展为表观遗传学研究开辟了新途径。日本杏林大学医学部的Kaishi Satomi研究团队在《Neuro-Oncology Advances》发表的研究中，创新性地将便携式Flongle测序芯片应用于MGMT启动子甲基化分析。该研究通过对比三种技术平台（焦磷酸测序、纳米孔测序）的检测结果，系统评估了长读长测序技术在临床甲基化分析中的适用性与准确性。

关键技术方法包括：选取3例经手术切除的GBM冰冻组织样本，通过亚硫酸盐处理将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶；采用焦磷酸测序专用引物对MGMT启动子区域进行PCR扩增；使用牛津纳米孔技术公司的快速测序试剂盒构建文库，并在Flongle芯片上完成测序；通过比对CpG位点的C/T信号比例判定甲基化状态。

研究结果

甲基化检测可行性验证

研究人员成功获取覆盖16个CpG位点的高质量测序数据，明确区分甲基化（保留胞嘧啶C）与非甲基化（转化为胸腺嘧啶T）位点。案例1显示C信号占比0%、T信号90%，提示未甲基化状态；案例2（C 21%/T 60%）与案例3（C 45%/T 23%）均符合甲基化特征，与焦磷酸测序结果高度一致。

技术优势与局限分析

纳米孔测序可直接识别表观遗传修饰，避免传统方法的片段化分析缺陷。但当前研究采用人工判读方式，未来需开发适应纳米孔测序误差特征的专用比对工具，以支持大规模临床样本分析。

临床转化前景

该技术平台将MGMT甲基化检测从中心实验室推向床边诊断，测序时长缩短至6小时内，为术中快速病理决策提供可能。尤其对于基层医疗单位，便携式测序仪可显著降低神经肿瘤分子分型的实施门槛。

研究结论表明，基于纳米孔长读长测序的MGMT启动子甲基化分析技术具有与金标准方法相当的检测效能，其操作简便、快速经济的优势为胶质母细胞瘤个体化治疗策略制定提供了新的技术支撑。值得注意的是，本研究虽样本量有限，但为后续大样本验证研究奠定了方法学基础。随着测序准确性的持续优化与自动化分析工具的完善，该技术有望成为神经肿瘤分子诊断的重要补充手段，最终实现TMZ化疗受益人群的精准筛选。