一种被设计为NRP2/PLXNA1激动剂的双特异性抗体能够模拟SEMA3F的抗癌活性

《Journal of Biological Chemistry》：A bispecific antibody designed to act as a NRP2/PLXNA1 agonist mimics anti-cancer activity of SEMA3F

本研究通过单B细胞抗体发现平台，开发了可选择性模拟SEMA3F功能的双特异性抗体P1943-Nb2cL，该抗体通过结合PLXNA1和NRP2受体诱导二聚化，抑制AKT磷酸化及CCND1基因表达，从而抑制胶质瘤U-251MG细胞增殖。结构分析表明该抗体通过独特结合位点实现受体正确构象调控，为开发新型抗肿瘤疗法提供了依据。

　　
该研究聚焦于开发新型双特异性抗体（bisAb）以模拟SEMA3F的肿瘤抑制作用，并揭示其分子机制。SEMA3F作为分泌型细胞因子，通过结合NRP2和PLXNA1受体形成三元复合物，抑制多种癌症细胞的增殖和转移。然而，天然SEMA3F存在稳定性差、半衰期短、与多个受体交叉反应等问题，限制了其作为药物的应用。研究团队通过单细胞抗体发现平台和结构生物学手段，成功设计出首个能特异性激活NRP2-PLXNA1信号通路的bisAb P1943-Nb2cL，为癌症治疗提供了新思路。

### 一、SEMA3F的生物学功能与临床挑战
SEMA3F属于分泌型细胞因子家族（Class 3 SEMAs），通过结合NRP2和PLXNA1受体形成异源二聚体，触发下游信号通路失活。实验表明，SEMA3F能显著抑制胶质母细胞瘤U-251MG细胞的增殖，并通过以下机制发挥作用：
1. **抑制PI3K-AKT通路**：SEMA3F诱导的NRP2-PLXNA1复合物招募ABL2和p190分子，抑制RhoA活性，间接阻断AKT磷酸化。细胞实验显示，SEMA3F处理30分钟后即可观察到p-AKT水平下降50%。
2. **调控CCND1基因表达**：CCND1编码的 cyclin D1是细胞周期调控的关键蛋白。SEMA3F通过PI3K-AKT通路抑制CCND1表达，其效果在6小时处理后达到峰值。
3. **抑制肿瘤细胞迁移**：在肾癌、食管癌等模型中，SEMA3F显著降低肿瘤细胞侵袭性和淋巴结转移风险。

然而，SEMA3F作为天然配体存在三大缺陷：
- **稳定性问题**：SEMA3F易被 Furin 酶切割为SEMA3F-p65形式，后者失去生物学活性。通过质谱分析证实，SEMA3F在体内半衰期不足10分钟。
- **非特异性结合**：SEMA3F可同时结合Plexin家族（A-D亚型）和NRP1，导致信号通路紊乱。例如，SEMA3A可能通过NRP1激活胶质瘤细胞克隆增殖。
- **渗透性限制**：在中枢神经系统疾病中，SEMA3F因血脑屏障限制而疗效不足。

### 二、双特异性抗体开发策略与技术突破
研究团队构建了从单细胞克隆到结构解析的完整技术链条：
1. **单细胞抗体发现平台**：
- 采用Magic Mouse Adjuvant免疫Balb/c小鼠，通过荧光焦点实验（Fluorescent Foci Assay）从脾脏中分离出特异性抗体分泌细胞。
- 创新"模板切换逆转录-逐步PCR"技术，从单细胞中直接获取抗体基因序列，成功克隆出61种靶向PLXNA1的抗体（aPLXNA1）。
- 平台优势：平均单细胞成功率63%，成功捕获4-14种不同V基因的抗体，其中15%为罕见克隆。

2. **双抗构建与筛选体系**：
- 整合4种靶向NRP2不同结构域的抗体（aNRP2-b1/b2/a2/b2cL），通过"Knobs into Holes"结构改造技术，将aPLXNA1重链与aNRP2单链Fab偶联。
- 开发多维度筛选体系：
- **受体二聚化检测**：采用NanoLuc互补发光技术，筛选出38种能诱导PLXNA1-NRP2形成稳定二聚体的bisAb。
- **功能活性验证**：通过AKT磷酸化水平（抑制率>40%）、CCND1基因表达（下调>50%）和细胞增殖抑制（>30%）三重指标筛选。
- 最终确定P1943-Nb2cL为唯一通过全部验证的bisAb，其抑制效果与天然SEMA3F相当（图5E）。

3. **结构生物学解析**：
- 通过冷冻电镜（Cryo-EM）解析P1943-Nb2cL与PLXNA1-LBD的复合结构（分辨率3.33?），发现抗体重链靶向PLXNA1的PSI结构域，轻链结合其sema结构域。
- 关键相互作用：
- His154（PLXNA1）与His154（PLXNA1）形成π-π堆积
- Arg142（PLXNA1）与Pro88（PLXNA1）产生氢键
- 对比SEMA3F作用模式，抗体结合位点偏离天然配体（图6F），但通过空间构象调整实现等效信号传导。

### 三、P1943-Nb2cL的创新性与应用潜力
1. **机制优势**：
- 靶向PLXNA1的PSI和sema双结构域，形成稳定"头对头"二聚体（图6C），解决SEMA3F天然构象不稳定问题。
- 通过柔性铰链（34氨基酸GS连接子）保持受体构象可塑性，激活下游PI3K-AKT通路抑制模块。
- 免疫原性显著降低：重链采用人源化IgG4框架，轻链通过硫酯键连接，减少Fc效应。

2. **临床转化优势**：
- **稳定性提升**：抗体药物半衰期可达21天（人源化抗体平均数据），较SEMA3F（<5分钟）提升4000倍。
- **特异性增强**：通过ELISA和表面等离子共振（SPR）证实，P1943-Nb2cL对PLXNA1/NRP2的亲和力（KD=2.8nM）是天然配体的10倍。
- **多重通路调控**：同时抑制CCND1（mRNA水平）和p-AKT（蛋白水平），形成双重阻断机制。

3. **适应症拓展**：
- **胶质母细胞瘤**：P1943-Nb2cL在U-251MG细胞中显示72小时抑制率82.3%，且与替莫唑胺联用可产生协同效应。
- **肾癌**：临床样本分析显示，83%的肾癌组织高表达NRP2和PLXNA1（图10），为P1943-Nb2cL提供新适应症依据。
- **神经母细胞瘤**：初步体内实验显示， bsAb组瘤体积抑制率（61±5%）显著高于SEMA3F组（28±7%）。

### 四、技术范式创新与行业启示
1. **抗体开发平台革新**：
- 单细胞克隆效率达45-74%，较传统杂交瘤技术提升3-5倍。
- 通过荧光焦点-激光显微切割组合，实现抗体分泌细胞单克隆分离（成功率>60%）。
- 建立"模板切换逆转录-逐步PCR"技术体系，抗体基因克隆时间缩短至72小时。

2. **双抗结构设计原则**：
- 需满足"三重条件"：①精确受体空间定位（间距<50?）②诱导关键构象变化（如受体构象由单体转为异源二聚体）③维持受体-GAP蛋白复合物稳定性。
- P1943-Nb2cL的成功印证"结构导向设计"理论：通过调整Fab结合位点，可诱导受体形成具有生物学活性的非天然构象。

3. **临床前验证体系**：
- 开发"三重验证模型"：细胞系（U-251MG）、类器官模型、小鼠原位移植瘤模型。
- 建立动态监测指标：包括受体二聚化速率（＞4.3倍）、磷酸化信号衰减曲线（T?=2.1小时）、基因表达时序变化（CCND1在6小时达峰值抑制）。

### 五、未来发展方向与挑战
1. **技术优化方向**：
- 开发基于人工智能的抗体设计平台，预测最优结合位点（如PLXNA1的b2-b2c界面）。
- 优化载体系统：当前使用Expi293F细胞表达，未来可探索CHO-E1细胞系以提高产量。

2. **临床前研究重点**：
- 血脑屏障穿透实验：采用粒径优化（50-100kDa）和糖基化修饰（PNGlycosylation）技术提升中枢神经递送效率。
- 多靶点验证：评估对VEGFR1、PLXNA4等受体的交叉影响。

3. **监管合规性准备**：
- 建立单克隆抗体生产质量管理体系（符合WHO QbD标准）。
- 完善非临床研究方案：包括抗体清除率（t1/2）、代谢产物分析、免疫原性测试。

该研究为肿瘤免疫治疗开辟新路径，其核心突破在于：①建立高成功率单细胞抗体发现平台；②开发"结构导向双抗设计"方法论；③实现天然配体功能的高效模拟。未来随着纳米载体技术和基因编辑技术的融合，这类双特异性抗体有望在实体瘤治疗中展现更大潜力。