创新精油配方NHK-EO体外抑制犬源产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌生物膜形成的研究

《Veterinary Research Communications》：Innovative essential oil formulations for in vitro inhibition of Biofilm-Forming Extended-Spectrum β-Lactamase–Producing Escherichia coli isolated from canine infectious diarrhea

为解决产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)大肠杆菌(E. coli)引起的犬感染性腹泻及耐药性问题，研究人员开展了一项关于创新精油配方NHK-EO的研究。结果表明，NHK-EO对ESBL-E. coli具有显著的抗菌和抗生物膜活性，其最低抑菌浓度(MIC)为1024-2048 μg/mL，在亚抑菌浓度下即可有效抑制生物膜形成。该研究为开发替代抗生素的天然治疗剂提供了新思路。

　　

在宠物医疗领域，犬感染性腹泻是一个常见且棘手的问题。近年来，随着抗生素的广泛使用，一种名为“产超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamase, ESBL)”的大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)逐渐成为兽医临床的噩梦。这种细菌不仅对青霉素、头孢菌素等多种常用抗生素产生耐药，更令人担忧的是，它们还拥有一种“秘密武器”——生物膜(Biofilm)。生物膜是细菌为了生存而分泌的一种粘稠的胞外基质，它像一层坚固的“盔甲”，将细菌包裹起来，使其能够抵抗抗生素的攻击、逃避宿主免疫系统的清除，从而导致慢性感染和反复发作。更糟糕的是，携带bla_CTX-M基因的ESBL-E. coli往往具有更强的生物膜形成能力，这使得治疗变得异常困难。

面对这一严峻挑战，寻找新型、有效的抗菌和抗生物膜策略迫在眉睫。天然产物，特别是植物精油(Essential Oils, EOs)，因其来源广泛、作用机制多样且不易产生耐药性，成为了研究热点。其中，来自左手香(Coleus amboinicus)、罗勒(Ocimum basilicum)和圣罗勒(Ocimum tenuiflorum)的精油已被证明具有广谱的抗菌活性。然而，单一精油的效果有限，而将不同精油进行科学配伍，有望通过协同作用产生更强的效果。

为此，来自泰国玛希隆大学(Mahidol University)兽医学院的研究团队开展了一项创新性研究。他们开发了一种名为NHK-EO的创新精油配方，旨在评估其对犬源ESBL-E. coli的抗菌和抗生物膜活性。该研究论文已发表于《Veterinary Research Communications》期刊。

为了验证NHK-EO的潜力，研究人员首先通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析了其化学成分，发现其主要活性成分为香芹酚(Carvacrol, 16.37%)、丁子香酚(Eugenol, 15.04%)和芳樟醇(Linalool, 13.97%)。随后，他们从56只犬（包括30只健康犬和26只腹泻犬）的直肠拭子中分离出78株革兰氏阴性菌，其中56株被鉴定为大肠杆菌。通过聚合酶链式反应(PCR)检测，他们发现其中4株（3株来自健康犬，1株来自腹泻犬）携带bla_CTX-M基因，且均为强生物膜形成菌。药敏试验显示，这些菌株对氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢泊肟和庆大霉素等抗生素完全耐药，凸显了其多重耐药特性。

NHK-EO对ESBL-E. coli具有显著的抗菌活性

研究人员采用微量肉汤稀释法测定了NHK-EO的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果显示，NHK-EO对所有测试菌株（包括4株bla_CTX-M阳性菌株）的MIC值为1024 μg/mL，MBC值为2048 μg/mL。MBC/MIC比值表明，NHK-EO对大肠杆菌具有杀菌作用。值得注意的是，NHK-EO对来自健康犬和腹泻犬的菌株表现出相似的抑菌效果，表明其抗菌活性不受菌株来源的影响。

NHK-EO在亚抑菌浓度下即可有效抑制生物膜形成

为了评估NHK-EO的抗生物膜能力，研究人员进行了两个关键实验：抑制生物膜形成实验和破坏已形成生物膜实验。结果令人振奋：在亚抑菌浓度（1/4 MIC, 256 μg/mL）下，NHK-EO即可显著抑制生物膜的形成，对4株bla_CTX-M阳性菌株的抑制率超过80%。更令人惊喜的是，NHK-EO同样能够有效破坏已经形成的成熟生物膜，在1/4 MIC浓度下，对来自腹泻犬的菌株生物膜抑制率超过75%，对4株bla_CTX-M阳性菌株的抑制率也超过50%。这表明NHK-EO不仅能够阻止细菌“筑巢”，还能“拆毁”它们已经建好的“堡垒”。

扫描电镜(SEM)直观证实NHK-EO的抗生物膜效果

为了更直观地观察NHK-EO对生物膜的破坏作用，研究人员利用扫描电子显微镜(SEM)进行了观察。在未处理的对照组中，大肠杆菌ATCC 25922形成了结构致密、由胞外基质包裹的典型生物膜，细菌细胞间通过菌毛等结构紧密连接。然而，在经NHK-EO处理后，情况发生了显著变化：随着NHK-EO浓度的增加（从1/8 MIC到1/2 MIC），生物膜结构逐渐瓦解，细菌密度显著降低，细胞间的连接结构消失，甚至出现了明显的形态学改变。这些图像证据有力地支持了NHK-EO具有强大抗生物膜活性的结论。

研究结论与讨论

本研究成功开发了一种由左手香、罗勒和圣罗勒精油组成的创新配方NHK-EO，并证实了其在体外对犬源ESBL-E. coli具有显著的抗菌和抗生物膜活性。NHK-EO中的主要活性成分（如香芹酚、丁子香酚和芳樟醇）可能通过破坏细菌细胞膜、抑制群体感应(Quorum Sensing)等机制，协同发挥抗菌和抗生物膜作用。

该研究为应对日益严峻的抗生素耐药性问题提供了新的解决方案。NHK-EO作为一种天然产物，有望成为传统抗生素的替代或辅助治疗剂，用于控制宠物中ESBL-E. coli的感染和传播，从而降低人畜共患病的风险。然而，研究人员也指出，NHK-EO的MIC值相对较高，这可能会限制其全身给药的临床应用。因此，未来研究应侧重于开发局部给药制剂（如用于皮肤、伤口或口腔感染），并进一步评估其体内安全性和有效性，以推动其向临床转化。