牛气管来源II型胶原与脱细胞透明软骨支架差异性调控间充质干细胞软骨分化及血管生成因子分泌的研究

《Cell and Tissue Research》：Collagen II and decellularized hyaline cartilage scaffolds derived from bovine trachea differentially promote chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells and decrease secretion of angiogenic factors

本研究针对关节软骨损伤修复中支架材料选择缺乏系统比较的问题，开展了牛气管来源II型胶原(Col II)与脱细胞透明软骨(DHC)支架的制备、表征及生物学性能评价。研究人员通过系统比较两种支架的微观结构、理化特性、力学性能及其对人脂肪源(hASC)和骨髓源(hBMSC)间充质干细胞软骨分化的影响，发现DHC支架更有利于促进透明软骨样组织形成，并显著降低血管生成因子(angiopoietin-1、VEGF、bFGF)的分泌。该研究为软骨组织工程支架材料的优化选择提供了重要实验依据，表明保留天然细胞外基质成分的DHC支架在抑制血管侵入方面具有独特优势。

　　

关节软骨损伤修复一直是骨科领域的重大挑战。由于软骨组织缺乏血管分布，自我修复能力极为有限。当前，利用生物相容性支架为细胞提供临时细胞外基质(ECL)的软骨组织工程策略备受关注，其中II型胶原(Col II)支架和脱细胞软骨基质(DHC)已成为修复受损关节软骨的重要材料。然而，尽管这两种材料均有应用，但尚无研究系统比较它们从同一来源制备时的特性差异及其对细胞行为的调控作用。

传统软骨组织工程多采用胶原I或I/III混合支架，但研究发现软骨细胞在Col II支架上能更好地维持球形形态和分化表型。同时，脱细胞软骨通过去除细胞和抗原成分，显示出良好的软骨修复潜力。但现有研究多采用关节、耳廓等小尺寸组织作为原料，制备效率低且成本高。牛气管作为大型动物组织来源，含有丰富的透明软骨，但其在关节软骨工程中的应用价值尚未充分探索。

针对这一研究空白，哥伦比亚国立大学的研究团队在《Cell and Tissue Research》上发表了最新成果。他们创新性地以牛气管为共同原料，同步制备了Col II支架和DHC支架，并首次系统比较了它们的微观结构、理化特性、力学性能及其对hASC和hBMSC软骨分化的差异性调控作用。

研究团队采用了一系列关键技术方法：通过酶消化-盐析法从牛气管分离Col II并构建多孔支架；建立了一种快速、经济的软骨脱细胞方案，结合组织学、生化检测(DNA、羟脯氨酸、GAGs定量)验证脱细胞效果；利用扫描电镜(SEM)分析支架孔径与孔隙率；通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)表征材料化学组成；采用液体吸附能力(LSC)、接触角(CA)和zeta电位(ζ)评估材料亲水性及表面特性；通过酶降解实验评价材料稳定性；利用力学测试仪测定杨氏模量和压缩模量；基于ISO 10993-5标准进行细胞毒性评价；通过MTT法检测细胞增殖；采用组织学(H&E、safranin O)、免疫组化(胶原I/II、聚集蛋白聚糖)和组织形态计量学分析新生组织类型；使用Luminex多重检测技术定量血管生成因子分泌。

表征结果

脱细胞效果验证显示DHC支架DNA含量降至4±1.6 ng/mg，显著低于天然软骨(82±11.5 ng/mg)，同时保留91.5%的胶原成分和4.6%的GAGs。微观结构分析表明Col II支架具有互联多孔结构(孔径264.9±84.1μm，孔隙率92%)，而DHC支架保持天然软骨结构(孔径36.6±7μm，孔隙率61.5%)。理化特性显示Col II支架的液体吸附能力(781.5%)显著高于DHC支架(228.9%)，但两者均呈亲水性(接触角<90°)和负电性。力学性能测试发现DHC支架的杨氏模量(0.135 MPa)和压缩模量(4.010 kPa)均显著高于Col II支架(0.038 MPa和0.185 kPa)。

生物学性能

细胞毒性实验证实两种支架均无细胞毒性(细胞存活率>70%)。细胞增殖实验显示Col II支架更利于细胞扩增，但DHC支架在软骨分化培养基诱导下能促进更高质量的软骨形成。组织形态计量学分析表明，hBMSC在DHC支架上合成高达64.66%的透明软骨样组织，而Col II支架以过渡性组织为主(36.93%)。免疫荧光定量进一步证实DHC支架上胶原II和聚集蛋白聚糖表达显著增强。

血管生成因子调控

研究发现软骨分化过程中，血管生成因子分泌与软骨形成程度呈负相关。hBMSC在DHC支架上培养时，angiopoietin-1、VEGF和bFGF的分泌量显著降低，且DHC支架组的因子浓度普遍低于Col II支架组。这表明DHC支架不仅能促进软骨生成，还可能通过下调血管生成因子分泌来维持软骨的无血管状态。

研究结论强调，虽然Col II支架在细胞增殖方面表现更优，但DHC支架在促进软骨分化、抑制血管生成方面展现出独特优势。这种差异主要归因于DHC支架保留的天然ECM成分及其特殊的微观结构，这些特性更有利于模拟软骨发育的微环境。该研究不仅为软骨修复材料的选择提供了科学依据，还揭示了支架材料通过调控血管生成因子分泌影响软骨稳态的新机制，对开发具有抗血管化功能的软骨修复产品具有重要指导意义。