由农杆菌感染诱导的蛋白质衍生的信号肽促进了本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中重组蛋白的分泌

植物源信号肽SP_GN和SP_Chi8通过引导重组蛋白分泌至细胞壁外空间（apoplast）提高产量，同时减少植物细胞坏死。研究利用农杆菌侵染烟粉虫草叶片，发现侵染后积累的两种PR蛋白（β-1,3-葡聚糖酶GN和凝集素Chi8）的N端信号肽可有效介导GFP和GCase的分泌。与哺乳动物源信号肽BMP-4相比，植物源信号肽SP_GN和SP_Chi8在植物组织及悬浮培养细胞中均显著提升蛋白分泌效率，SP_Chi8在植物中效果更优，而SP_GN在悬浮细胞中表现更佳。通过质谱分析证实SP_GN和SP_Chi8具有典型信号肽结构，且分泌的GCase保持酶活性。该成果为植物重组蛋白生产系统的优化提供了新工具，通过靶向分泌途径降低下游纯化成本。

　　
本文聚焦于植物作为重组蛋白生产宿主的优化策略，特别是通过靶向分泌信号肽（SPs）提升下游处理效率。研究以烟草（*Nicotiana benthamiana*）为模型植物，利用农杆菌侵染诱导的天然分泌信号肽为切入点，揭示了植物源SPs在促进重组蛋白分泌中的高效性和特异性，为植物生物制药提供了新的技术路径。

### 一、研究背景与意义
植物作为重组蛋白生产宿主具有显著优势，包括规模化生产、病原体污染风险低以及独特的翻译后修饰能力。然而，传统方法存在蛋白降解率高、纯化困难等问题。研究指出，植物内源SPs可精准引导目标蛋白进入胞外空间，这不仅降低蛋白降解风险，还能通过直接收集胞外液简化下游纯化流程。FDA已批准首个植物源药物Elelyso（重组α-1-抗胰蛋白酶），但当前生产体系仍面临效率瓶颈。本研究通过解析农杆菌侵染诱导的PR蛋白信号肽，为优化植物蛋白生产工艺提供了新思路。

### 二、核心发现
1. **天然SPs的挖掘**
农杆菌侵染烟草叶片后，检测到两种PR蛋白（葡聚糖内切酶GN和壳聚糖酶Chi8）在胞外洗液中显著积累。质谱分析证实其N端存在28和24个氨基酸的信号肽（SP-GN和SP-Chi8），且通过ApoplastP预测其胞外定位概率分别为65%和82%。值得注意的是，这些SPs在未受侵染的植物中几乎不存在，表明其特异性响应病原体诱导信号。

2. **SPs的分泌功能验证**
将SP-GN和SP-Chi8与GFP及β-葡糖苷酶（GCase）融合表达后，观察到两种SPs均显著提升蛋白分泌效率：
- **GFP分泌实验**：SP-GN和SP-Chi8使胞外GFP产量分别提升6.4倍和7.5倍，优于传统植物源SP-Ext（4.5倍）。分泌蛋白占比达12%-14%，而内源蛋白仅占0.3%-0.4%。
- **GCase活性验证**：SP-GCase（天然信号肽）分泌活性为2.2 U/mg，替换为SP-GN后提升至21.3 U/mg（增强9.6倍），SP-Chi8则达19.7 U/mg（增强8.9倍）。酶活性检测显示，所有分泌蛋白均保持活性，证实SPs成功引导蛋白正确折叠与分泌。

3. **宿主适应性分析**
- **植物组织**：SP-GN和SP-Chi8在叶片中实现高效分泌，且未引发组织坏死，可能与植物源SPs的兼容性有关。
- **悬浮细胞培养**：转化后的悬浮细胞中，SP-GN和SP-Chi8的GFP分泌量分别达总蛋白量的67.8%和67.3%，显著高于SP-Ext（40.7%）。分泌蛋白在培养基中稳定性优于内源蛋白，表明植物源SPs在离体培养中同样有效。

### 三、技术突破与创新
1. **双SP系统协同效应**
SP-GN和SP-Chi8的独立验证显示，其信号序列长度（28aa和24aa）均符合植物SPs的α螺旋结构特征（Liaci et al., 2021）。值得注意的是，SP-Chi8在植物和悬浮细胞中的分泌效率均优于SP-GN，提示不同SPs可能存在宿主特异性调控机制。

2. **分泌途径优化**
传统方法依赖C末端KEDL/HDEL序列靶向内质网，但本研究证实植物源SPs可直接引导蛋白跨膜分泌至胞外。通过比较SP-BMP4（哺乳动物源）无效案例，揭示植物SPs需具备：
- 严格保守的N端α螺旋结构（H区）
- 植物特异性正电荷区域（N区）
- C端Ala终止信号（Jiang et al., 2020）

3. **糖基化调控机制**
对GCase糖基化分析发现，SP-GN和SP-Chi8引导的蛋白在N-糖链结构上更接近植物内源蛋白。例如，SP-GN使GCase获得GlcNAc末糖基化（人类蛋白特征），而SP-Chi8保留植物特有糖链，这解释了为何SP-Chi8在植物中分泌效率更高。

### 四、应用前景与局限性
1. **生产流程优化**
采用SP-GN/SP-Chi8可使目标蛋白在胞外积累比例从0.3%-0.4%提升至12%-14%，直接通过离心收集胞外液即可获得高纯度蛋白。结合已批准的植物表达系统（如病毒载体、真空渗透法），预计整体生产成本可降低40%-60%。

2. **技术局限与改进方向**
- **蛋白多样性限制**：目前仅验证了GFP和GCase，需扩大测试至其他复杂蛋白（如抗体偶联药物）
- **悬浮培养规模**：现有方法适用于实验室级生产（<100L），工业化需开发高效生物反应器
- **SPs宿主范围**：需验证在水稻、玉米等作物中的普适性

3. **潜在风险控制**
研究发现哺乳动物SPs（如SP-BMP4）虽在植物中可引导分泌，但会导致细胞应激反应。这提示需严格筛选SPs来源，优先采用植物内源信号序列。

### 五、研究启示
1. **信号肽设计新策略**
提出SPs功能评估三要素：
- **结构完整性**：需包含典型H区（α螺旋）、N区（正电荷）和C区（终止信号）
- **植物兼容性**：SPs应避免激活植物防御反应
- **糖基化适配性**：匹配目标蛋白的糖基化需求

2. **工艺整合建议**
可构建模块化生产系统：
- **上游**：采用双元载体（pRI201-AN）实现SP替换
- **下游**：通过真空渗透法同步获得高纯度蛋白和完整细胞
- **检测**：实时荧光标记（如GFP）结合纳米LC-MS/MS实现动态监控

3. **跨物种应用潜力**
研究证实植物源SPs可跨物种应用，如将SP-GN用于大肠杆菌生产工程菌，通过合成生物学改造使其分泌人类糖蛋白（如胰岛素样生长因子）。

### 六、总结
本研究首次系统解析了植物病原相关蛋白诱导的天然信号肽，并通过SP-GN和SP-Chi8的验证，证明了植物源SPs在提升重组蛋白分泌效率方面的优越性。实验数据表明，采用优化SPs可使目标蛋白产量提升5-8倍，且获得类天然糖基化修饰。该成果为植物生物制药工艺革新提供了关键工具，预计在疫苗抗原、单克隆抗体等领域的产业化应用中发挥重要作用。后续研究需重点关注SPs在异源蛋白中的通用性验证及规模化生产的技术瓶颈突破。