NAT10介导的PIK3R2 mRNA N4-乙酰胞苷（ac4C）修饰促进胶质母细胞瘤恶性进展

《Cell Death & Disease》：NAT10-mediated N4-acetylcytidine (ac4C) modification of PIK3R2 mRNA promotes malignant progression of glioblastoma

本研究聚焦胶质母细胞瘤（GBM）恶性进展的分子机制。研究人员围绕RNA表观遗传修饰关键酶NAT10及其介导的N4-乙酰胞苷（ac4C）修饰开展系统性研究，发现NAT10通过ac4C修饰增强PIK3R2 mRNA稳定性，进而激活PI3K/AKT信号通路，促进GBM细胞的增殖、迁移、侵袭及原神经-间质转化（PMT）。该研究揭示了NAT10-PIK3R2轴在GBM恶性进展中的关键作用，为GBM靶向治疗提供了新策略。

　　

在大脑这个人体最精密的指挥中心，胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme, GBM）是最常见且最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，堪称“癌王”之一。尽管现代医学采用了手术、放疗和化疗相结合的激进方案，患者的中位生存期依然难以突破15个月，其快速进展、高度恶性及易复发的特性对临床治疗构成了巨大挑战。近年来，分子靶向治疗为GBM患者带来了一线希望，而表观遗传调控，特别是RNA修饰（RNA modification）领域，逐渐成为揭示肿瘤恶性本质的新突破口。

在多种RNA修饰中，N4-乙酰胞苷（N4-acetylcytidine, ac⁴C）是一种古老而保守的化学修饰，它如同给mRNA分子打上了一个个“标记”，影响着mRNA的稳定性、出核运输和翻译效率。NAT10（N-acetyltransferase 10）是目前已知唯一能够催化ac⁴C修饰的乙酰转移酶，其在结肠癌、膀胱癌等多种实体瘤中被证实扮演着癌基因的角色。然而，NAT10及其介导的ac⁴C修饰在GBM恶性进展中的具体功能和分子机制，仍有大量未知亟待探索。近期虽有研究指出NAT10可通过乙酰化JARID2 mRNA促进GBM恶性进展，但其调控网络显然更为复杂。与此同时，PI3K/AKT信号通路是GBM等人类肿瘤中频繁激活的关键致癌通路，其调控亚基PIK3R2（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 2）在GBM中高表达，并与肿瘤细胞增殖和替莫唑胺（TMZ）耐药相关，但其过表达的上游调控机制尚不明确。为了解决上述问题，孟宪南、董涛等研究人员在《Cell Death & Disease》上发表了他们的最新研究成果，系统揭示了NAT10通过ac⁴C修饰调控PIK3R2 mRNA稳定性，进而驱动GBM恶性进程的新机制。

为开展此项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。他们利用来自临床蛋白质组肿瘤分析联盟（CPTAC）、癌症基因组图谱（TCGA）和中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）的公共数据库进行生物信息学分析，并收集了来自徐州医科大学附属医院的428例胶质瘤组织微阵列（TMA）样本和30例新鲜胶质瘤组织样本进行免疫组织化学（IHC）验证。在细胞功能实验中，他们通过慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）和小干扰RNA（siRNA）敲低NAT10表达，并使用特异性NAT10抑制剂Remodelin进行处理，利用CCK-8法、平板克隆形成实验、Transwell小室实验评估GBM细胞（U87, LN229）的增殖、迁移和侵袭能力。在分子机制层面，他们通过RNA免疫共沉淀（RIP）、ac⁴C-RIP、RNA Pull-down、放线菌素D（Actinomycin D） assay、蛋白质印迹（Western blot）等技术探究了NAT10与PIK3R2 mRNA的直接结合、ac⁴C修饰对其稳定性的影响以及下游PI3K/AKT通路的激活情况。此外，他们还构建了NAT10的乙酰转移酶活性缺失突变体（ΔN-acetyltransferase）和RNA结合活性缺失突变体（ΔRNA helicase）以验证其功能依赖性，并通过裸鼠原位成瘤模型在体内评估了NAT10-PIK3R2轴对GBM生长的促进作用。

NAT10在胶质瘤中高表达且与恶性程度及不良预后正相关

研究人员首先通过数据库分析和实验验证发现，NAT10在胶质瘤组织中的表达水平显著高于正常脑组织，且其表达量与肿瘤的WHO分级呈正相关，即高级别胶质瘤（III-IV级）中的NAT10表达水平远高于低级别胶质瘤（I-II级）。对199例具有完整预后信息患者的生存分析显示，NAT10高表达的患者总生存期显著短于低表达患者，表明NAT10是胶质瘤患者不良预后的潜在预测指标。

敲低NAT10抑制GBM细胞体外增殖

为了探究NAT10的生物学功能，研究团队在U87和LN229两种GBM细胞系中敲低了NAT10的表达。结果表明，敲低NAT10显著抑制了细胞的增殖活力（CCK-8法）和克隆形成能力。同样，使用NAT10特异性抑制剂Remodelin处理细胞，也观察到了类似的增殖抑制效果，证实了NAT10在促进GBM细胞增殖中的关键作用。

敲低NAT10抑制GBM细胞体外迁移和侵袭

鉴于原神经-间质转化（PMT）在GBM侵袭性中的核心地位，研究人员进一步检测了NAT10对细胞迁移和侵袭的影响。Transwell实验结果显示，敲低NAT10或Remodelin处理均能显著削弱GBM细胞的迁移和侵袭能力。同时，蛋白质印迹分析发现，敲低NAT10后，间质转化相关标志物如FN1、N-cadherin、Vimentin和Snail的蛋白表达水平均明显下调，提示NAT10可能通过调控PMT过程影响GBM的侵袭性。

NAT10通过ac⁴C修饰增强PIK3R2 mRNA稳定性

机制探索是本研究的核心。点杂交（Dot blot）实验证实敲低NAT10会降低GBM细胞中总的RNA ac⁴C修饰水平。通过交叉分析公共数据库的RNA-seq和acRIP-seq数据，并结合qPCR验证，研究人员将下游靶点锁定为PIK3R2。进一步的实验表明，NAT10能正向调控PIK3R2的mRNA和蛋白表达。功能回复实验显示，NAT10的乙酰转移酶活性和RNA结合活性对于其调控PIK3R2表达至关重要。通过生物信息学预测（PACES网站）和RNA Pull-down实验，他们鉴定出PIK3R2 mRNA上两个保守的ac⁴C修饰位点，并证实NAT10直接结合这些位点。RIP和ac⁴C-RIP实验进一步证明了NAT10与PIK3R2 mRNA的直接相互作用，以及敲低NAT10会降低PIK3R2 mRNA的ac⁴C修饰水平和稳定性。放线菌素D assay直接证实了NAT10通过ac⁴C修饰延长了PIK3R2 mRNA的半衰期。

NAT10通过调控PIK3R2影响PI3K/AKT通路激活

鉴于PIK3R2是PI3K通路的关键调控亚基，研究人员检测了NAT10对PI3K/AKT通路的影响。蛋白质印迹结果显示，敲低NAT10或Remodelin处理均能显著降低AKT蛋白在Ser473位点的磷酸化水平（p-AKT），而不影响总AKT蛋白量，表明NAT10通过上调PIK3R2激活了PI3K/AKT信号通路。

上调PIK3R2表达是NAT10调控GBM细胞功能所必需的

为了确认PIK3R2是NAT10发挥作用的关键下游效应分子，研究团队在敲低NAT10的GBM细胞中过表达了PIK3R2。结果显示，过表达PIK3R2能够逆转因NAT10敲低导致的p-AKT水平下降、PMT标志物表达下调以及细胞增殖、迁移和侵袭能力受损，充分证明了PIK3R2在介导NAT10促癌功能中的核心地位。

NAT10在体内促进GBM进展

最后，通过裸鼠原位成瘤模型，研究人员在体内验证了NAT10的功能。与体外实验结果一致，敲低NAT10能显著抑制GBM细胞在脑内的生长（通过活体成像监测荧光强度），并且肿瘤组织IHC染色显示NAT10和PIK3R2的表达均降低。体内回复实验进一步证实，同时过表达PIK3R2可以部分挽救因敲低NAT10导致的肿瘤生长抑制和p-AKT水平下降。

NAT10-PIK3R2轴与胶质瘤患者临床病理特征的关系

临床相关性分析显示，在胶质瘤患者组织样本中，NAT10与PIK3R2的表达呈显著正相关，且两者在高级别胶质瘤中的表达均高于低级别胶质瘤，进一步将基础研究发现与临床实际联系起来，凸显了NAT10-PIK3R2轴的临床意义。

本研究得出结论：NAT10在胶质瘤中高表达，通过其乙酰转移酶活性直接催化PIK3R2 mRNA发生ac⁴C修饰，从而增强PIK3R2 mRNA的稳定性，导致其表达上调。高表达的PIK3R2进而激活PI3K/AKT信号通路，并诱导原神经-间质转化（PMT），最终驱动胶质母细胞瘤的恶性增殖、侵袭和进展。这项研究不仅深化了对RNA修饰在肿瘤中作用的理解，更重要的是揭示了NAT10-PIK3R2这一新的致癌轴，为开发以NAT10为靶点的胶质母细胞瘤治疗策略提供了坚实的理论依据和实验支持。特别是NAT10小分子抑制剂Remodelin在实验中展现出的抗肿瘤效果，为其潜在的临床转化价值带来了希望。