通过在线顺序堆叠富集技术，并结合毛细管电泳法，验证唾液中支链氨基酸与体重指数（BMI）之间的关系

《Journal of Chromatography B》：Online sequential stacking enrichment to verify the relationship between branched chain amino acids in saliva and body mass index by capillary electrophoresis

该研究采用毛细管电泳-紫外检测法结合扫集与酸暴雨堆叠富集技术，直接检测唾液中支链氨基酸（BCAAs），优化后Val、Leu、Ile富集因子达49.3、58.2、56.4，检测限低至0.25-0.28 μg/mL，初步发现唾液BCAAs水平与BMI呈正相关。

　　

Jianzhu Han|Na Guo|Sijia Zhou|Yijia Chen|Wenqiang Yang|Zhaoyan Wang

兰州大学药学院，中国兰州730000

摘要

近年来，肥胖症的发病率有所上升，研究表明肥胖者血液中的支链氨基酸（BCAA）水平通常较高。然而，唾液中BCAA含量与肥胖之间的关系尚未明确。在本研究中，采用毛细管电泳结合紫外检测（CE-UV）技术在15分钟内直接测定了唾液中的BCAA，并通过序列堆叠增强结合扫描（ABS）技术提高了检测灵敏度。在优化条件下，缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）的富集倍数分别为49.3、58.2和56.4。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的检测限（LOD）分别为0.28、0.25和0.26 μg/mL，定量限（LOQ）分别为0.94、0.83和0.88 μg/mL。通过对16名志愿者的唾液样本进行检测，发现唾液中的BCAA水平与体重指数（BMI）之间存在初步的正相关关系。

引言

肥胖已成为全球性的流行病[1]，并与心血管疾病[2]、糖尿病[3]及多种并发症[4]密切相关。体重指数（BMI）是临床实践中常用的肥胖评估指标[5]。支链氨基酸（BCAA），包括缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile），是必需氨基酸，必须从饮食中获取，动物体内无法自身合成[6]。它们在蛋白质合成、代谢[7]和心血管疾病[8]等方面起着重要作用。研究表明，肥胖者的BCAA水平高于正常人群[9][10][11]。此外，肥胖儿童的血浆BCAA浓度也较高[12]，肥胖母亲的母乳中BCAA含量也较高[13]。因此，准确测量BCAA水平对于监测肥胖相关疾病至关重要。目前检测BCAA的方法包括气相色谱-质谱联用（GC-MS）[14]、高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）[15][16][17][18][19][20][21]、紫外（UV）检测或荧光检测后的HPLC[22]、衍生化后的毛细管电泳（CE）[24]、UV吸收或荧光检测[26][27][28][29]以及非接触式电导检测（C⁴D）[30][31][32][33][34][35]。然而，除了Qiu报道的直接在195 nm处检测BCAA的方法[24]外，目前尚无低成本且有效的直接使用紫外检测的CE方法。

唾液是一种多功能生物流体，含有多种生物标志物[36]。与基于血液的生物标志物相比，唾液检测方法具有成本低、无创性强、重复性好等优点[37]，且获取相对容易，适用于需要连续采样的检测[38]。然而，大约80%的BCAA存在于血液循环系统中[39]，唾液中的BCAA浓度较低[21]，因此需要一种简单、快速且高灵敏度的唾液BCAA检测方法。

CE-UV是一种常见、简单直接的检测方法[39]。但由于紫外检测器的灵敏度较低，传统的CE-UV方法难以满足低浓度样本的检测需求。为解决这一问题，常采用在线富集策略来提高CE的灵敏度[41][42][43][44][45][46]。扫描技术是一种有效的在线样品富集方法，通过表面活性剂、聚合物、络合剂和过渡金属等载体实现分析物的富集和积累[47,48]。铜离子是一种常用的分析物载体，在氨基酸检测中效果显著[49,50]。分析过程中，氨基酸的氨基氮原子和羧基氧原子上的孤对电子与铜(II)的空轨道配位，形成氨基酸-铜(II)螯合物[49,50]，这些螯合物在254 nm处具有强紫外吸收。这样，即使BCAA的紫外吸收较弱，也能被富集并直接检测到。Aebersold首次提出的酸 barrage 堆叠（ABS）技术通过在大体积样品注入后注入一定量的酸，也能有效富集生物流体中的分析物[52,53]。例如，Zhang等人利用ABS技术检测大鼠体内的四种异黄酮，检测灵敏度提高了24.5–33.7倍[54]。因此，结合扫描和ABS技术可以进一步提高CE-UV分析的灵敏度。

本研究的目的是建立一种基于CE的高灵敏度检测方法，用于快速测定唾液中的BCAA。采用扫描和ABS富集技术相结合的方法进一步提高了CE的灵敏度，并初步探讨了同一年龄组志愿者唾液中BCAA水平与BMI之间的关系。

化学物质与材料

缬氨酸（L-Val）、亮氨酸（L-Leu）和异亮氨酸（L-Ile）购自云南生物科技有限公司（上海，纯度>99.5%）；硫酸铜（CuSO₄购自双双化学试剂有限公司（烟台，中国）；α-环糊精（α-CD）购自上海Macklin公司（上海，中国）；醋酸（AcOH）、盐酸（HCl）、硫酸（H₂SO₄）、磷酸（H₃PO₄）和甲酸（HCOOH）购自山东禹王药业有限公司（山东，中国）。

选择分离胶

在BCAA的分离和检测过程中，铜(II)会与BCAA形成紫外吸收螯合物，从而无需进行衍生化预处理。同时，铜(II)还作为载体参与扫描过程中的BCAA富集和积累。因此，铜(II)的浓度是一个重要因素。如图1a所示，当CuSO₄浓度从10 mM增加到50 mM时，BCAA的峰强度增加。

结论

本研究建立了一种简单、快速且高效的CE-UV方法用于BCAA的测定。通过扫描和ABS富集技术，无需衍生化即可直接检测BCAA。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的富集倍数分别为49.3、58.2和56.4，检测限分别为0.28、0.25和0.26 μg/mL。建议在后续应用中加入适当的内标物以提高方法的稳健性。

作者贡献声明

Jianzhu Han：方法验证、实验设计、数据分析、数据整理、概念构建。Na Guo：写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、实验设计。Sijia Zhou：写作——审稿与编辑、实验设计、数据分析。Yijia Chen：数据分析。Wenqiang Yang：数据分析。Zhaoyan Wang：写作——审稿与编辑、项目监督、资金申请、概念构建。

机构审查委员会声明

本研究已获得兰州大学药学院伦理委员会的批准。所有受试者均签署了书面知情同意书，样本信息已匿名处理以确保参与者隐私。

未引用参考文献

[40], [51]

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了甘肃省自然科学基金（编号：22JR5RA495）的支持。