细菌SMC蛋白MukB内表面残基在体外ssDNA结合中的作用及其对染色体分离的影响

《Communications Biology》：Involvement of the inner surface residues of bacterial SMC protein MukB in the ssDNA binding in vitro

本研究针对细菌染色体组织蛋白MukB如何特异性识别单链DNA(ssDNA)这一关键问题，通过系统性地对其头部结构域内表面带正电荷的残基进行定点突变（如R61、K75、R112等），结合体外生化实验（EMSA、拓扑结合实验）和体内功能验证（细胞生长、核质分离观察），发现这些残基对MukB优先结合ssDNA至关重要，且突变体（如K75E）表现出ssDNA结合能力显著下降而dsDNA结合影响较小的特异性缺陷。该研究揭示了MukB通过其头部结构域内表面特定残基阵列实现ssDNA偏好性结合的分子机制，为理解细菌凝聚素在染色体特异性区域（如高转录rm操纵子）的定位和功能提供了新见解。

　　

在微观的细菌世界里，遗传物质DNA被紧密地压缩在狭小的细胞空间内，这一过程的精确性对于生命的延续至关重要。新复制完成的染色体必须被正确地分离到两个子细胞中，任何差错都可能导致细胞死亡或功能异常。在这一过程中，一类名为结构维持染色体(SMC)的蛋白质家族扮演了核心角色。在大肠杆菌中，负责染色体组织和分离的关键凝聚素是MukBEF复合物，其核心亚基MukB蛋白能够形成环状结构，以拓扑学的方式“套住”DNA分子。有趣的是，早期的研究发现，纯化的MukB蛋白在体外表现出对单链DNA(ssDNA)更强的结合偏好，其结合效率高于双链DNA(dsDNA)。然而，这种偏好性的分子基础及其在细菌细胞内的生物学意义，长期以来一直是一个未解之谜。

细菌染色体上存在一些特殊的区域，例如多个核糖体RNA(rm)基因操纵子，它们通常位于复制起点(oriC)附近。这些区域转录活性极高，容易形成R环（一种DNA-RNA杂交体），从而暴露出相对稳定的ssDNA区域。这不禁让人猜想，MukB是否正是利用其对ssDNA的偏好性结合能力，来靶向这些特定区域，进而实现其在oriC邻近区域的富集，最终确保染色体的正确分离？为了验证这一假说，并揭示MukB识别ssDNA的分子机制，来自日本国家遗传学研究所和综合研究大学院大学的研究团队在《Communications Biology》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员为了深入探索MukB与DNA相互作用的细节，主要运用了几项关键技术。他们首先通过定点突变技术，系统性地将MukB头部结构域内表面的12个带正电荷的残基分别替换为带负电的谷氨酸(E)或不带电荷的谷氨酰胺(Q)，构建了一系列突变体。随后，利用电泳迁移率变动分析(EMSA)来定量评估这些突变体蛋白与ssDNA和dsDNA的结合能力。为了专门研究蛋白质环状结构对DNA的拓扑学捕获，他们采用了基于组氨酸标签纯化的拓扑结合实验（或称“pull-down”实验），使用环状ssDNA作为底物，并通过高盐洗涤去除非拓扑结合的DNA。在细胞水平，他们通过将突变体基因回补至mukB基因缺失的大肠杆菌菌株中，评估了这些突变对细胞在高温下的生长能力以及核质（染色体）分离状况的影响。此外，免疫印迹技术被用来确认突变体蛋白在细胞内的表达水平。

结果：关键残基的鉴定与功能分析

研究人员首先将目光投向了MukB头部结构域的内表面。基于同源蛋白（来自Haemophilus ducreyi）的晶体结构分析，他们发现从R61到K119的区域位于闭合蛋白质环的内表面，且包含12个进化上保守的带正电荷残基，这些残基是潜在的DNA相互作用位点。

多个头部结构域突变体表现出温度敏感的生长缺陷

为了评估这些残基的生物学功能，研究人员构建了24个单点突变的MukB蛋白。功能互补实验显示，其中六个突变体（R61E、R61Q、K75E、K80E、K80Q和R112E）无法挽救mukB缺失菌株在37°C高温下的生长缺陷。值得注意的是，对于K75和R112位点，只有当替换为带负电的氨基酸（E或D）时才会导致功能丧失，而替换为保持正电荷的氨基酸（如K75R、R112K）或中性氨基酸则不影响功能。这表明这些位点对电荷敏感，特别是负电荷的引入会破坏其功能。

氨基酸替换突变体在染色体分离中的缺陷

显微镜观察发现，上述生长缺陷的突变体（除K80Q外）以及R99E突变体，均无法有效纠正mukB缺失导致的染色体分离异常，表现为无核细胞和异常核质形态的比例显著升高。其中，R99E突变体虽然能在高温下支持细胞生长，但仍导致高频率的染色体分离错误，提示其功能存在部分缺陷。

氨基酸替换突变体的DNA结合活性

通过EMSA实验定量分析突变体蛋白的DNA结合能力。野生型MukB对ssDNA和dsDNA的结合亲和力相近（[MukB]₅₀值分别为13.3 nM和12.0 nM）。研究发现，多个谷氨酸替换突变体（如R61E、K75E、R99E、R112E、R114E、K115E、K119E）的ssDNA结合能力显著下降。尤为关键的是，K75E突变体表现出明显的选择性缺陷：其ssDNA结合能力大幅降低（[MukB]₅₀= 45.5 nM），而dsDNA结合能力与野生型相当。类似地，R61E和R114E也主要影响ssDNA结合。相反，R99E和K119E则同等地削弱了对两种DNA的结合。大多数谷氨酰胺替换突变体（除R73Q和R99Q外）的DNA结合能力则接近野生型，其中R99Q对dsDNA的结合影响尤为严重。

氨基酸替换突变体的拓扑DNA结合活性

为了评估突变是否影响MukB环状结构对DNA的拓扑学捕获，研究人员进行了拓扑结合实验。结果显示，那些在EMSA中ssDNA结合受损的谷氨酸突变体（R61E、K75E、R112E、R114E、R115E）其拓扑结合ssDNA的能力也显著降低。而相应的谷氨酰胺突变体则保留了与野生型相当的拓扑结合活性。R99E和R99Q突变体的拓扑结合能力仅有轻微下降。实验同时证实，被捕获的是环状DNA而非线性DNA，确认为拓扑结合。

讨论与结论

本研究成功鉴定出MukB头部结构域内表面的多个关键残基（R61、K75、R112、R114、K115），它们共同构成了MukB偏好性结合ssDNA的结构基础。其中，R61、K75和R112被认为是形成ssDNA结合“主轴”的核心残基，它们的突变不仅严重影响体外ssDNA结合和拓扑捕获，也导致体内染色体分离缺陷和温度敏感生长。而R114和K115可能起到辅助稳定结合的作用。R99和K119则可能参与一个非必需且对dsDNA结合影响更大的DNA结合界面。

研究者提出了一个精妙的工作模型来解释MukB为何偏好结合ssDNA：在热运动驱动下，MukB二聚体的环状结构不断开合。当头部结构域闭合时，来自两个亚基的R61、K75和R112残基在环内表面排列成一行，形成一个带正电荷的“沟槽”，这个沟槽在空间和化学特性上更适合与柔性的ssDNA骨架相互作用。结合上的ssDNA如同一条“纽带”，可以跨越并稳定闭合的MukB头部。相比之下，刚性的dsDNA可能难以适应这种结合模式。这种ssDNA的特异性结合，可能为MukBEF复合物在染色体上高转录区域（如rm操纵子）或DNA复制叉处（暴露出ssDNA）的初始加载提供了机制。

值得注意的是，R61和K80也被证明是MukB的ABC转运蛋白型ATP酶活性所必需的，这解释了为何即使DNA结合能力未受严重影响（如K80Q），其突变仍会导致细胞功能完全丧失。本研究将MukB的ssDNA结合能力与其在染色体组织中的潜在功能联系起来，为理解细菌凝聚素如何通过感知DNA的二级结构来实现其特异性染色体定位迈出了重要一步。未来的研究需要进一步阐明这种结合模式在活细胞染色体上的具体作用，以及MukEF非SMC亚基和ATP水解如何调控这一过程。