他莫昔芬诱导小鼠轮廓味上皮从增殖向分化的转录开关及其对味觉研究的潜在影响

《Scientific Reports》：Tamoxifen triggers a transcriptional switch from proliferation to differentiation in the circumvallate taste epithelium in mice

本研究针对他莫昔芬诱导Cre-loxP系统在味觉研究中广泛应用但其直接效应未知的问题，通过单次腹腔注射他莫昔芬，结合qPCR、RNA-seq和免疫组化等技术，发现他莫昔芬剂量依赖性地抑制味蕾细胞补充，并诱导轮廓味上皮发生从增殖向分化的转录转换，上调I-III型成熟味细胞标志物表达，下调IV型前体细胞标志物Shh。该研究揭示了他莫昔芬作为潜在混杂因素的重要性，为味觉研究实验设计提供了关键参考。

　　

在生命科学研究中，他莫昔芬诱导的Cre-loxP系统已成为实现时空特异性基因重组的金标准技术。这一技术在味蕾研究中的应用日益广泛，被用于谱系追踪、干细胞特性分析以及特定基因功能研究。然而，作为选择性雌激素受体调节剂的他莫昔芬，除了通过雌激素受体发挥作用外，还能通过非雌激素受体途径产生多种生物学效应，如诱导细胞周期阻滞、抑制线粒体呼吸和促进凋亡。在胰腺和骨骼等组织中，他莫昔芬已被证实会对细胞增殖产生组织特异性影响。那么，在味觉系统中，他莫昔芬是否也会对味蕾细胞动态产生直接干扰？这一问题成为了味觉研究领域亟待解答的关键问题。

味蕾作为动物的化学感受门户，在识别营养物质和避免有毒物质方面起着至关重要的作用。味蕾细胞起源于上皮，由双潜能干细胞持续更新维持。成熟味蕾细胞可分为I-IV四种类型，其中IV型细胞是表达Sonic hedgehog(Shh)的基底细胞，是I-III型成熟细胞的有丝分裂后前体细胞。随着分子生物学技术的进步，特别是RNA测序技术的应用，味蕾维持的分子机制正在被逐步揭示。在此背景下，精确评估他莫昔芬对味蕾的直接效应对于确保实验结果的可靠性变得尤为重要。

本研究旨在探究单次腹腔注射他莫昔芬对小鼠轮廓味上皮的影响，重点关注其对味蕾细胞补充、基因表达谱和细胞分化的影响。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用野生型C57BL/6J雄性小鼠（来自Japan SLC）避免雌激素周期干扰；通过酶消化法分离轮廓味上皮进行全标本免疫组织化学分析；利用定量实时PCR(qPCR)检测味细胞标志物表达；进行RNA测序(RNA-seq)并结合基因集富集分析(GSEA)探索通路水平变化；通过EdU标记和检测技术追踪细胞增殖动态；使用激光共聚焦显微镜进行三维图像重建和定量分析。

Tamoxifen上调I、II和III型标志物但下调IV型标志物在轮廓乳头中的表达

通过定量RT-PCR分析发现，他莫昔芬注射后一天，I、II和III型成熟味细胞标志物(Entpd2、Tas1r3、Pkd2l1)呈剂量依赖性上调，而IV型未成熟细胞标志物Shh则被下调。5 mg剂量组中，成熟细胞标志物表达量达到对照组的1.4倍以上，而Shh表达降至对照组的0.6倍。

Tamoxifen不改变细胞类型标志物特异性也不增加II型细胞数量

三重全标本免疫组织化学显示，即使在5 mg他莫昔芬处理下，IP3R3(III型细胞标志物)和CA4(III型细胞标志物)信号仍完全分离，POU2F3(II型细胞特异性转录因子)仅表达于IP3R3阳性细胞中。定量分析表明，他莫昔芬处理组与对照组之间每个味蕾中POU2F3阳性细胞数量无显著差异(11.3±0.9 vs 11.4±0.9)。

Tamoxifen减少SHH阳性细胞但不改变S期细胞数量

免疫组织化学显示，5 mg他莫昔芬处理显著减少了SHH阳性细胞数量。然而，EdU注射后2小时的分析表明，他莫昔芬处理组与对照组之间单位面积上皮中的S期细胞数量无显著差异，说明他莫昔芬注射一天后并未立即影响细胞增殖。

Tamoxifen以剂量依赖性方式减少向味蕾的细胞供应

通过EdU追踪实验发现，他莫昔芬以剂量依赖方式减少48小时内进入味蕾的新细胞数量。数据符合逻辑曲线(IC₅₀为2.27 mg/20 g体重)，3 mg剂量组首次出现显著减少，5 mg剂量组味蕾中EdU阳性细胞频率降至对照组的6%以下。这种减少不仅限于味蕾内部，周围上皮中的EdU阳性细胞也显著减少。

RNA测序分析他莫昔芬诱导的CV味上皮基因表达变化

RNA-seq分析显示，他莫昔芬处理导致整体基因表达变化相对温和。基因集富集分析发现TASTE_TRANSDUCTION通路显著上调，而DNA_REPLICATION和MISMATCH_REPAIR通路下调。味蕾细胞特异性基因中，I-III型细胞标志物均上调，包括II型细胞分化关键转录因子Pou2f3、III型细胞分化关键转录因子Ascl1和Nkx2-2。相反，IV型细胞特异性基因Shh被下调。

从增殖到分化的转录变化伴随线粒体能量合成减少

GO生物过程分析显示，最显著下调的基因集中有三个与细胞增殖相关，六个与线粒体ATP合成功能相关。而上调的基因集中五个与上皮细胞和角质形成细胞分化相关，四个与神经元分子特征相关。具体基因表达分析表明，角质形成细胞分化相关基因(Krt10、Ivl、Flg)上调，而未成熟上皮细胞标志物Krt14下调。细胞增殖相关基因(Mki67、Pcna、多数细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶)下调，而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂Cdkn1a(p21)上调。

Tamoxifen诱导的调控增殖与分化平衡的转录因子表达变化

转录因子分析显示，Fos和Fosb(AP-1家族成员)是最显著上调的转录因子之一，已知在上皮细胞分化中起关键作用。而Foxm1是最显著下调的转录因子之一，该因子在维持干细胞和祖细胞增殖中发挥重要作用。

本研究通过多角度实验证实，他莫昔芬在常用诱导剂量下能显著改变轮廓味上皮的细胞动力学。他莫昔芬不仅抑制味蕾细胞补充，还诱导了从增殖向分化的转录程序转换。在味蕾内部，他莫昔芬广泛上调所有味细胞类型的标志基因，同时下调未成熟前体细胞标志物Shh。在周围上皮中，他莫昔芬促进上皮和角质形成细胞分化相关基因表达，抑制未成熟基底细胞标志物表达。

特别值得注意的是，他莫昔芬诱导的转录变化涉及关键调控因子AP-1和Foxm1。AP-1作为应激诱导因子，已知在上皮分化中起重要作用；而Foxm1则是维持细胞周期进程的关键因子。两者之间可能存在直接和间接的调控关系：Foxm1下调可能通过调节染色质可及性直接诱导AP-1表达，也可能通过降低活性氧清除剂表达导致活性氧水平升高，间接诱导AP-1表达。

这些发现对他莫昔芬诱导Cre-loxP系统在味觉研究中的应用具有重要意义。研究表明，他莫昔芬本身会改变转录程序和细胞稳态，因此在实验设计中必须将其作为潜在混杂因素加以考虑。研究人员确定的半数抑制浓度(IC₅₀，2.27 mg/20 g体重)为未来实验的剂量选择提供了重要参考。有趣的是，已有研究报道连续10天每日注射2 mg/20 g体重他莫昔芬并未引起II型细胞数量显著变化，与本研究确定的IC₅₀值相吻合，进一步支持了研究结论的可靠性。

该研究不仅揭示了他莫昔芬对味上皮的直接效应，也为理解味蕾细胞分化和维持的调控机制提供了新视角。Foxm1-AP-1调控轴的发现为探索味上皮稳态维持的分子机制开辟了新方向，未来研究可进一步阐明这一调控网络在味觉功能中的作用，为开发味觉障碍治疗策略提供理论基础。

论文发表于《Scientific Reports》，为味觉研究领域提供了重要方法论参考，提醒研究人员在使用他莫昔芬诱导系统时需谨慎考虑其直接效应，并为进一步优化实验方案提供了科学依据。