CCL8通过诱导M1巨噬细胞极化及NF-κB p65通路激活抑制卵巢癌进展

《Scientific Reports》：CCL8 suppresses ovarian cancer progression via M1 macrophage polarization and NF-κB-mediated apoptosis

卵巢癌（OC）是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其发病隐匿、死亡率高，亟需新的治疗靶点。本研究聚焦于趋化因子CCL8在OC中的作用，发现CCL8在OC中高表达且与良好预后相关。机制上，CCL8通过诱导巨噬细胞向M1表型极化，并激活肿瘤细胞中的NF-κB p65通路，从而促进肿瘤细胞凋亡，抑制其增殖、迁移和侵袭。该研究揭示了CCL8在OC中作为抑癌因子的新角色，为OC的免疫治疗提供了新的潜在靶点。

　　

卵巢癌（Ovarian Cancer, OC）是女性生殖系统中最致命的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下。由于早期症状不明显，大多数患者在确诊时已处于晚期，并伴有广泛的腹腔转移，导致治疗难度极大，5年生存率仅为30%左右。因此，深入探索卵巢癌发生发展的分子机制，寻找新的治疗靶点，是当前临床面临的重大挑战。

肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）在肿瘤的发生、发展和转移中扮演着关键角色。其中，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）是肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞之一。巨噬细胞具有高度的可塑性，根据微环境信号的不同，可极化为具有抗肿瘤作用的M1表型或促肿瘤作用的M2表型。在卵巢癌中，M2型巨噬细胞通常与肿瘤的免疫逃逸、血管生成和转移相关，而M1型巨噬细胞则被认为具有抑制肿瘤生长的能力。因此，如何将促肿瘤的M2型巨噬细胞“改造”为抗肿瘤的M1型，已成为肿瘤免疫治疗领域的研究热点。

趋化因子是一类能够招募免疫细胞的小分子蛋白，在肿瘤免疫中发挥着“交通信号灯”般的作用。CCL8（CC motif chemokine ligand 8），也被称为单核细胞趋化蛋白-2（MCP-2），是趋化因子家族的重要成员。然而，CCL8在肿瘤中的作用却像一个“双面间谍”，在不同的肿瘤类型中扮演着截然相反的角色。在黑色素瘤和鼻咽癌中，CCL8表现出抗肿瘤活性；而在急性髓系白血病、乳腺癌和结直肠癌中，它却促进肿瘤的进展和转移。那么，在卵巢癌这个“战场”上，CCL8究竟是“敌”是“友”？它能否通过调控巨噬细胞来影响卵巢癌的进程？这些问题亟待解答。

为了回答这些问题，来自江苏大学附属医院的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项研究，揭示了CCL8在卵巢癌中通过诱导M1巨噬细胞极化并激活NF-κB通路，从而发挥抑癌作用的新机制。

关键技术方法

本研究综合利用了生物信息学分析、临床样本验证和体外细胞实验等多种技术手段。首先，研究人员利用TCGA、GTEx和GEO等公共数据库，分析了CCL8在卵巢癌中的表达、预后价值及其与免疫细胞浸润的相关性。同时，收集了10对卵巢癌及癌旁组织样本进行免疫组化验证。在体外实验中，利用PMA诱导人单核细胞系THP1分化为M0巨噬细胞，随后用重组人CCL8蛋白或CCL8过表达质粒处理，诱导其向M1表型极化。收集这些巨噬细胞的条件培养基（Conditioned Medium, CM）处理卵巢癌细胞系ES2，通过CCK-8、克隆形成、Transwell迁移/侵袭、流式细胞术、TUNEL染色和Western blot等技术，系统评估了CCL8诱导的巨噬细胞对ES2细胞增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）和凋亡的影响，并深入探讨了NF-κB p65信号通路在其中扮演的关键角色。

研究结果

CCL8在卵巢癌中高表达且与良好预后相关

研究人员首先对TCGA和GTEx数据库的转录组数据进行分析，发现与正常卵巢组织相比，卵巢癌组织中存在大量差异表达基因。KEGG通路富集分析显示，上调基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路等免疫相关通路中。通过韦恩图分析，研究人员锁定了15个在多个免疫通路中重叠的趋化因子，其中CCL8在卵巢癌组织中的表达上调最为显著。这一结果在GEPIA数据库和GSE18520数据集中得到了验证。此外，研究人员还通过qRT-PCR和免疫组化实验证实，CCL8在卵巢癌细胞系ES2和临床卵巢癌组织中的表达均显著高于正常对照。令人惊喜的是，生存分析显示，CCL8高表达的卵巢癌患者总生存期更长，且肿瘤分期更早，提示CCL8在卵巢癌中可能扮演着“保护者”的角色。

CCL8表达与M1巨噬细胞浸润和活化呈正相关

既然CCL8与良好预后相关，那么它是如何发挥作用的呢？研究人员利用TIMER数据库进行了免疫浸润分析，发现CCL8的表达与巨噬细胞，特别是M1型巨噬细胞的浸润水平呈显著正相关。同时，CCL8的表达也与M1型巨噬细胞的标志物（如CD80、CD86、IL-1β、IFN-γ、CXCL9等）的表达水平呈正相关。在临床组织样本中，免疫组化染色也证实，CCL8高表达的区域，M1型巨噬细胞标志物CXCL9的表达也相应较高。最重要的是，生存分析显示，CCL8高表达且M1巨噬细胞浸润丰富的患者，其预后最好。这些结果提示，CCL8可能通过招募和活化M1型巨噬细胞，从而在卵巢癌中发挥抗肿瘤作用。

CCL8诱导的M1巨噬细胞抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移

为了验证CCL8对巨噬细胞极化的直接作用，研究人员在体外用重组CCL8蛋白处理THP1来源的巨噬细胞。结果显示，CCL8处理显著上调了M1型标志物（IL-1β、IL-6、CXCL10）的mRNA表达，并下调了M2型标志物ARG的表达。Western blot和流式细胞术结果也证实，CCL8处理增加了M1标志物CD80/CD86的表达，而M2标志物CD206的表达则受到抑制。这些结果说明，CCL8能够直接诱导巨噬细胞向M1表型极化。

接下来，研究人员收集了CCL8诱导的巨噬细胞的条件培养基（CCL8-CM），并用其处理卵巢癌细胞ES2。结果发现，与对照组相比，CCL8-CM处理显著抑制了ES2细胞的克隆形成能力、细胞活力和增殖能力。同时，Transwell实验表明，CCL8-CM处理也显著抑制了ES2细胞的迁移和侵袭能力。进一步的机制探索发现，CCL8-CM处理上调了上皮标志物E-cadherin的表达，下调了间质标志物N-cadherin以及基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达，表明CCL8诱导的巨噬细胞能够抑制卵巢癌细胞的EMT进程。此外，增殖相关蛋白PCNA和干性相关蛋白Oct4的表达也显著下调。这些结果共同表明，CCL8诱导的M1巨噬细胞能够通过分泌某些因子，有效抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为。

CCL8诱导的M1巨噬细胞通过NF-κB p65通路促进卵巢癌细胞凋亡

为了探究CCL8诱导的巨噬细胞抑制肿瘤生长的深层机制，研究人员对GSEA分析结果进行了验证。GSEA分析显示，NF-κB诱导激酶活性相关的基因集在卵巢癌组织中富集。Western blot实验证实，CCL8-CM处理能够促进p65蛋白从细胞质向细胞核的转位，表明NF-κB信号通路被激活。进一步的研究发现，CCL8-CM处理显著上调了促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白Caspase 3的表达，同时TUNEL染色和流式细胞术检测也显示，CCL8-CM处理显著增加了ES2细胞的凋亡率。

为了确认NF-κB p65通路在此过程中的关键作用，研究人员在CCL8-CM处理ES2细胞的同时，加入了p65的特异性抑制剂。结果显示，p65抑制剂能够有效阻断p65的核转位。更重要的是，p65抑制剂能够逆转CCL8-CM诱导的促凋亡效应，表现为Bax和Caspase 3表达的下调，以及抗凋亡蛋白Bcl-2表达的上调。同时，TUNEL染色和流式细胞术检测也证实，p65抑制剂显著降低了ES2细胞的凋亡率。这些结果有力地证明，CCL8诱导的M1巨噬细胞正是通过激活NF-κB p65信号通路，来促进卵巢癌细胞的凋亡。

结论与讨论

本研究系统性地揭示了趋化因子CCL8在卵巢癌中扮演的抑癌新角色。研究证实，CCL8在卵巢癌中高表达，且与良好的患者预后和M1型巨噬细胞的浸润密切相关。在机制上，CCL8能够直接诱导巨噬细胞向具有抗肿瘤活性的M1表型极化。这些被CCL8“改造”后的M1巨噬细胞，通过分泌某些因子，不仅能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT进程，更重要的是，它们能够激活肿瘤细胞内的NF-κB p65信号通路，从而上调促凋亡蛋白Bax和Caspase 3的表达，最终诱导肿瘤细胞发生凋亡。

这项研究的意义在于，它首次阐明了CCL8在卵巢癌中通过调控巨噬细胞极化和NF-κB通路来发挥抑癌作用的完整分子机制。这一发现不仅深化了我们对卵巢癌免疫微环境的理解，也为开发新的卵巢癌免疫治疗策略提供了重要的理论依据。靶向CCL8或其下游信号通路，或许能够成为重塑肿瘤免疫微环境、增强抗肿瘤免疫应答的有效手段，为改善卵巢癌患者的预后带来新的希望。