干扰素诱导蛋白MxB通过激活RIG-I/MAVS先天免疫通路抑制乙型肝炎病毒复制的新机制

《Scientific Reports》：The interferon-inducible MxB large GTPase attenuates hepatitis B virus replication by activating the RIG-I innate immunity signaling pathway

本刊推荐：为解决HBV如何逃逸先天免疫及MxB蛋白的抗病毒机制问题，研究人员开展了MxB通过调控线粒体功能影响RIG-I/MAVS信号通路的研究。发现MxB缺失导致线粒体形态异常、MAVS聚簇减少，削弱IFN应答，反而增强HBV Dane颗粒释放。该研究揭示了MxB-MAVS轴是抑制HBV复制的关键机制，为靶向先天免疫的HBV治疗提供了新策略。

　　

在全球范围内，乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是导致肝硬化和肝细胞癌的主要风险因素。尽管已有有效疫苗和抗病毒药物（如核苷（酸）类似物和干扰素），但实现乙肝表面抗原（HBsAg）清除——即功能性治愈——仍然困难重重。HBV能够建立持续性感染，部分原因在于其可有效逃避宿主的先天免疫应答。因此，深入理解HBV与宿主免疫系统之间的相互作用，特别是揭示病毒限制因子如何发挥作用，对于开发新的治疗策略至关重要。

干扰素诱导的髓瘤病毒抵抗蛋白2（MxB，亦称MX2）是动力蛋白样大GTP酶家族成员，已知对HIV-1、疱疹病毒和丙型肝炎病毒（HCV）等多种病毒具有抑制作用。近期研究表明MxB也能抑制HBV，但其具体分子机制尚未完全阐明。特别有趣的是，MxB被发现定位于线粒体内膜，参与调控线粒体形态和功能，而线粒体正是先天免疫信号通路中的关键枢纽，例如作为线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）的锚定位点。MAVS是维甲酸诱导基因I（RIG-I）样受体信号通路中的关键衔接蛋白，RIG-I能够识别病毒RNA（如HBV前基因组RNA末端的ε茎环结构），进而引发MAVS聚集，激活下游信号，最终诱导I型和III型干扰素（IFN）的产生。基于MxB与线粒体的密切关联，研究人员提出科学假设：MxB是否通过调控线粒体功能，影响RIG-I-MAVS信号通路，从而发挥其抗HBV作用？为了验证这一假说，来自日本东北大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。

本研究主要应用了以下关键技术方法：利用HBV表达细胞系（HepAD38, HepG2.2.15.7）和HBV易感细胞系（HepG2-hNTCP-C4）进行体外模型构建；通过siRNA介导的基因敲低和质粒过表达技术调控MxB表达；采用免疫印迹（Western blotting）、Northern印迹、实时荧光定量PCR（qPCR）和化学发光免疫分析法（CLIA）检测病毒蛋白、RNA和抗原水平；通过免疫沉淀和蔗糖密度梯度离心分析病毒颗粒；利用免疫荧光显微镜和半变性去污剂凝胶电泳（SDD-AGE）观察线粒体形态和MAVS聚集；并使用来自97例患者（包括慢性乙型肝炎CHB、慢性丙型肝炎CHC和代谢功能障碍相关脂肪肝病MASLD）的肝活检组织样本进行MxB表达的临床相关性分析。

MxB敲低引起线粒体形态改变并增强HBV复制

研究人员首先在HBV表达的HepAD38细胞中敲低MxB蛋白。结果发现，MxB的缺失导致线粒体形态发生显著改变，变得更为圆润和碎片化（线粒体圆形度增加，纵横比降低）。这表明MxB对于维持正常的线粒体形态至关重要。随后，他们检测了MxB敲低对HBV复制的影响。在多种HBV细胞模型（HepG2.2.15.7, HepAD38）以及HBV感染模型（HepG2-hNTCP-C4）中，MxB敲低均导致细胞培养上清中的HBsAg水平显著升高（4-10倍），HBV DNA水平也有不同程度增加。特别值得注意的是，在HBV感染模型中，MxB敲低使HBsAg和HBV DNA在整个感染周期（第7-13天）均维持在较高水平。

MxB敲低促进Dane颗粒的释放

为了明确MxB影响的是哪种类型的病毒颗粒，研究人员进行了蔗糖密度梯度离心分析和免疫沉淀实验。结果表明，在对照组细胞中，HBV DNA呈现两个峰值，分别对应成熟的Dane颗粒（低密度）和裸露的核衣壳颗粒（高密度）。而在MxB敲低细胞中，Dane颗粒对应的HBV DNA峰值显著增高。通过抗-HBs抗体进行免疫沉淀特异性富集有包膜的病毒颗粒后，实时PCR检测证实，MxB敲低确实显著增加了Dane颗粒的数量。

MxB通过调控病毒包膜蛋白表达抑制HBV

机制探索发现，MxB敲低选择性地增加了乙肝病毒大、中、小表面蛋白（L/M/S HBs）在细胞内的表达水平，而对乙肝核心蛋白（HBc）的表达无显著影响。Northern印迹结果进一步显示，MxB敲低特异性增加了编码包膜蛋白的2.4/2.1 kb HBV mRNA的转录水平，而对3.5 kb的前基因组/前核心mRNA无明显影响。过表达野生型MxB能降低L/M/S HBs水平，而GTP酶活性缺陷的MxB突变体（K131A）则效果减弱，表明MxB的抗病毒作用依赖于其GTP酶活性。

MxB缺失削弱RIG-I信号通路

由于线粒体是RIG-I信号通路的核心，研究者接下来探讨了MxB是否影响该通路。用双链RNA类似物聚肌胞苷酸（poly(I:C)）刺激细胞后，MxB敲低显著抑制了下游信号分子TANK结合激酶1（TBK1）和干扰素调节因子3（IRF3）的磷酸化。同时，poly(I:C)诱导的I型干扰素（IFNA4, IFNB1）和III型干扰素（IFNL1, IFNL2-3）的mRNA表达上调也在MxB敲低细胞中被明显削弱。更重要的是，当转染可被RIG-I识别的HBV ε RNA时，MxB敲低同样削弱了III型干扰素的诱导表达。

MxB是MAVS有效聚集所必需的

RIG-I信号通路的激活依赖于MAVS在线粒体上形成大的聚集体。免疫荧光显微镜观察显示，在对照组细胞中，MAVS以明显的簇状结构定位在线粒体上。然而，在MxB敲低的细胞中，线粒体形态异常，且其上的MAVS簇状结构显著减少。通过半变性去污剂凝胶电泳（SDD-AGE）检测MAVS的聚集状态，发现MxB敲低后，MAVS的高分子量聚集物减少，而总MAVS蛋白量并未改变。这证明MxB并非影响MAVS的表达，而是影响其功能性聚集体的形成。

HBV感染者肝内MxB诱导程度有限

为了解MxB在临床感染中的情况，研究人员分析了患者肝组织样本。尽管公共数据库（GSE83148）分析显示慢性HBV感染者肝内MxB mRNA水平高于健康对照，但与慢性丙型肝炎（CHC）患者相比，慢性乙型肝炎（CHB）患者肝内的MxB mRNA和蛋白表达水平均显著较低，而与代谢功能障碍相关脂肪肝病（MASLD）患者水平相近。这表明在自然感染状态下，HBV可能未能有效诱导或甚至抑制了MxB的充分表达。此外，在CHB患者中，MxB mRNA水平与血小板计数呈正相关，提示其可能与肝纤维化进程存在关联。

本研究结论与讨论部分指出，研究人员揭示了一条全新的MxB介导的抗HBV机制。MxB通过维持线粒体正常形态，促进RIG-I识别病毒RNA后MAVS的有效聚集，从而放大先天免疫信号，诱导I型和III型干扰素的产生。这些干扰素及其刺激产生的效应分子（可能包括MxB自身）进而抑制HBV包膜蛋白的表达，最终减少有感染性的Dane颗粒的组装和释放。这项工作确立了MxB-MAVS轴在对抗HBV感染中的关键作用。研究发现HBV自然感染时肝内MxB诱导不强，这或许解释了HBV为何能建立持续性感染。因此，设法特异性诱导或增强肝细胞内MxB的表达和功能，有望打破HBV的免疫逃逸，为开发旨在实现HBV功能性治愈的新疗法（如与现有核苷（酸）类似物或聚乙二醇化干扰素联合使用）提供了重要的理论依据和潜在的新靶点。