拟南芥SLAH家族阴离子通道的协同调控机制及tRNA抑制功能的结构解析

《Nature Communications》：Structural insights into the coordinated regulation of the SLAH family in Arabidopsis thaliana

本研究针对植物如何通过阴离子通道调控逆境响应这一关键问题，开展了对拟南芥SLAH家族蛋白的结构与功能研究。通过冷冻电镜技术解析了SLAH3同源三聚体、SLAH1-tRNA复合物及异源复合物的高分辨率结构，首次发现tRNA作为抑制性调控亚基直接结合SLAH1通道的胞内入口。电生理实验证实tRNA降解或关键位点突变可激活SLAH1电流，并增强ABA诱导的气孔关闭。该研究揭示了植物逆境适应的分子基础，为作物抗逆育种提供了新靶点。

　　

植物在生长过程中需要应对各种生物和非生物胁迫，其中阴离子通道在调节气孔运动、水分平衡和逆境响应中发挥着关键作用。拟南芥SLAC/SLAH家族包含五个成员，其中SLAC1和SLAH3的研究较为深入，而SLAH1、SLAH2和SLAH4的功能机制尚不明确。尤其值得注意的是，SLAH1与SLAH3可形成异源复合物参与阴离子转运，但其精确的调控机制和结构基础一直是领域内的空白。理解这些通道如何协同工作，对于阐明植物适应逆境的分子机制具有重要意义。

本研究综合运用冷冻电镜技术、电生理记录、生物化学分析及植物体内实验等多种手段，系统研究了SLAH家族蛋白的结构与功能。研究人员通过HEK293F细胞表达系统纯化了SLAH3同源三聚体、SLAH1-tRNA复合物以及SLAH1-SLAH3异源复合物，并利用单颗粒冷冻电镜技术解析了这些复合物的高分辨率结构。同时，通过中国仓鼠卵巢细胞和拟南芥原生质体的膜片钳记录，分析了通道的电流特性。此外，还通过双分子荧光互补技术验证了蛋白互作，并通过烟草瞬时表达系统研究了气孔运动调控。

Structural determination of the AtSLAH3 Channel

研究人员首先通过冷冻电镜解析了SLAH3同源三聚体的结构，分辨率达到2.63?。结构分析显示，SLAH3每个单体包含10个跨膜螺旋，其通道在胞外侧较窄而胞内侧较宽。关键的苯丙氨酸残基F346、V403、F517和F336构成了离子传导路径。与SLAC1结构比较发现，F517（对应SLAC1中的F450）在SLAC/SLAH家族中完全保守，位于孔道中央，在门控中起关键作用。突变实验进一步证实，破坏SLAH3胞内"塞子"结构或跨膜区相互作用可部分激活通道活性。

Biochemical characterization and structural determination of the AtSLAH3-SLAH1 heterocomplex

研究发现SLAH1和SLAH3可形成两种异源三聚体：一种包含2个SLAH1和1个SLAH3，另一种包含1个SLAH1和2个SLAH3。在2SLAH1+1SLAH3复合物的冷冻电镜图中，研究人员意外发现了一个倒L形的额外密度，经鉴定为tRNA分子。RNA测序显示，87.45%的核酸为tRNA，其中tRNA-His-GTG-1-1是主要类型。该tRNA直接结合在SLAH1亚基上，占据通道的胞内入口。

tRNA binding on the SLAH3-SLAH1 heterocomplexes

结构分析表明，在2SLAH1+1SLAH3+tRNA复合物中，tRNA不对称结合，形成两个SLAH1与SLAH3之间的接触界面。界面1靠近tRNA的反密码子环，SLAH1的TM1与SLAH3的TM3和TM5形成广泛的疏水接触；界面2靠近tRNA的T环，主要涉及SLAH3的TM3与SLAH1的TM4和TM5之间的疏水作用。而在1SLAH1+2SLAH3复合物中，类似的极性和疏水相互作用稳定了异源三聚体。

tRNA binds on the SLAH1 to inhibit channel function

研究人员进一步解析了SLAH1同源三聚体的结构，发现tRNA同样结合于SLAH1三聚体。与SLAH3不同，SLAH1缺乏足够的末端形成胞内"塞子"，使得tRNA能够占据通道孔径，维持通道处于失活状态。电生理记录显示，即使与OST1激酶共表达，SLAH1也仅产生微弱电流，但加入RNase A降解tRNA后，可观察到强烈的SLAH1电流，证实tRNA对通道活性的抑制作用。

Structural comparison between the four SLAH homo and hetero complex

研究共解析了四种复合物结构：SLAH1-tRNA、2SLAH1+SLAH3+tRNA、SLAH1+2SLAH3和3SLAH3。比较分析发现，tRNA在3SLAH1+tRNA和2SLAH1+SLAH3+tRNA复合物中均结合于两个SLAH1单体之间，表明tRNA结合至少需要两个SLAH1单体。所有SLAH1和SLAH3单体均采用闭合构象，最窄收缩位点小于1?，可能代表无外界刺激时SLAH家族蛋白的最低能量状态。

Ion permeation of the SLAH family

离子选择性实验表明，SLAH3对NO₃^-具有显著偏好性，而SLAH1对NO₃^-和Cl^-的通透性相当。关键残基突变实验发现，SLAH1中的R47A和R198A突变几乎完全消除了全细胞电流，表明这些带正电荷的残基对阴离子通透至关重要。这些正电荷残基在膜两侧的存在影响了阴离子的招募和转运功能，构成了SLAH家族蛋白阴离子通透性差异的基础。

Dynamic interactions within SLAH homo and hetero complex in Planta

通过双分子荧光互补技术，研究人员在植物体内验证了SLAH1与SLAH3的动态相互作用。ABA处理3小时后，SLAH1与SLAH3的互作增强，而6小时后减弱。当SLAH1与SLAH3共表达时，ABA处理可增强SLAH3同源互作，同时减弱SLAH1同源互作。这些结果表明，SLAH通道在植物体内的组装是一个动态过程，可能随着ABA诱导从SLAH1同源三聚体转变为SLAH1-SLAH3异源复合物，最终形成SLAH3同源三聚体。

研究结论与讨论部分强调，该研究首次揭示了tRNA作为SLAH1通道的内源性抑制因子，提出了一个精细的调控模型：在正常生理条件下，SLAH1-SLAH3异源复合物促进Cl^-外排，支持植物生长；而在逆境胁迫下，ABA信号通路激活导致tRNA积累，tRNA结合SLAH1并稳定其闭合构象，同时SLAH1表达下调，促使通道复合物向SLAH3同源三聚体转变，从而介导NO₃^-外排和气孔关闭。该模型为理解植物逆境适应提供了新视角，tRNA调控离子通道的发现也拓展了tRNA生物学功能的认识。

研究还探讨了SLAH3通过组氨酸残基感知胞质酸化的机制，以及SLAH家族成员之间形成异源复合物的潜力。尽管体外实验显示SLAH家族蛋白可发生广泛的物理相互作用，但体内功能实验表明SLAH1仅特异性激活SLAH3，这种差异的机制有待进一步研究。

总之，该研究通过整合结构生物学、电生理学和生物化学方法，深入揭示了SLAH家族阴离子通道的协同调控机制，为作物抗逆改良提供了重要的理论基础和分子靶点。研究成果发表于《Nature Communications》，对植物逆境生物学领域具有重要推动作用。