对映选择性蛋白质亲和选择质谱（E-ASMS）：一种用于弱结合配体发现的高通量灵敏平台

《Nature Communications》：Enantioselective protein affinity selection mass spectrometry (E-ASMS)

本刊推荐：针对高通量化学配体发现中假阳性率高、弱亲和力结合子难以检测的挑战，Wang等人开发了对映选择性蛋白质亲和选择质谱（E-ASMS）新方法。研究通过筛选8,217种外消旋体化合物库，针对31种人类蛋白质成功鉴定出16个结合子，其中7个对六个靶点表现出对映选择性结合，KD值低至3 μM。该方法灵敏度高，能为配体结合提供正交证据，显著推进了难靶点蛋白质的化学探针发现进程。

　　

在生命科学和药物研发领域，大多数人类蛋白质仍然缺乏已知的化学配体，这极大地限制了对这些蛋白质功能的研究以及将其作为药物治疗靶点的可能性。传统的配体发现方法，如基于片段的先导化合物发现（FBLD）或DNA编码库（DEL）筛选，虽然广泛应用，但往往面临假阳性率高、对弱亲和力结合子（解离常数K_D> 10 μM）检测不灵敏、以及后续验证过程耗时耗力等挑战。特别是，当初始筛选出的“命中”化合物结合力较弱时，区分真实结合与假阳性信号变得异常困难，常常需要投入比初始筛选更多的资源进行验证。因此，开发一种能够高效、可靠地发现并初步验证弱结合配体的新方法，对于加速“不可成药”蛋白质的探索至关重要。

为了解决这一关键问题，由多伦多大学Hui Peng和Levon Halabelian共同领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种名为“对映选择性蛋白质亲和选择质谱”（Enantioselective protein affinity selection mass spectrometry, E-ASMS）的新方法。该方法巧妙地将亲和选择质谱的高通量优势与手性化合物对映选择性结合的特异性相结合，不仅能够灵敏地检测到弱结合配体，还能为结合事件提供强大的正交验证证据，从而显著提高了配体发现的效率和可靠性。

为了开展这项研究，作者们主要运用了几个关键技术方法。首先，他们设计并构建了一个包含8,217种具有类药性质的外消旋体（racemate）化合物的筛选库，并预先建立了其中约7,000种化合物的手性色谱分离条件数据库。核心的E-ASMS实验流程是将组蛋白（polyhistidine-tagged）标签的纯化重组蛋白固定在镍磁珠上，与化合物库（每个化合物浓度0.1 μM）孵育，洗去未结合化合物后，用甲醇洗脱结合物，并通过高分辨质谱进行鉴定。通过比较同一批次实验中不同蛋白靶点间的化合物富集程度（>5倍）来初步筛选候选结合子。最关键的一步是对候选结合子的洗脱液进行手性色谱分析，若某一对映体在蛋白洗脱液中的比例相对于原始库发生显著富集，则为其特异性结合提供了强有力的正交证据。随后，研究利用表面等离子共振（SPR）和光谱位移（SpS）等生物物理方法对结合进行定量验证，并通过X射线晶体学解析了多个蛋白-配体复合物的三维结构，从分子层面阐明了结合和对映选择性的机制。

设计和基准测试E-ASMS平台

研究人员首先设计了E-ASMS的工作流程（图1a）。其核心思想是：将多个蛋白靶点并行筛选，通过比较化合物在不同靶点间的富集程度来初步判断结合特异性；更重要的是，对于在某个靶点上富集的候选手性化合物，通过分析其在蛋白洗脱液中对映体的比例是否发生变化，来为特异性结合提供正交证据。为了验证这一概念的可行性，他们使用了四个已知具有对映选择性结合的蛋白-配体对（如CRBN蛋白与(S)-来那度胺）进行测试。结果证实，E-ASMS能够成功捕获到这些已知配体，并且手性分析清晰地显示了对映体富集现象（图1b-e）。随后，他们系统评估了E-ASMS的灵敏度。与传统的尺寸排阻色谱耦合的AS-MS（SEC-coupled AS-MS）方法相比，E-ASMS能够检测到近所有高亲和力（K_D< 1 μM）、一半的中等亲和力（1 μM ≤ K_D< 10 μM）以及20%的低亲和力（K_D≥ 10 μM）配体，而SEC-ASMS方法则完全丢失了中、低亲和力的配体（图1i）。这表明E-ASMS在检测弱结合子方面具有显著优势。

E-ASMS平台在新靶点中的应用

在方法验证成功后，研究团队将E-ASMS应用于31个具有不同生物学功能、三维结构和“可配体性”（ligandability）的人类蛋白质。这些靶点包括根据药物样密度（DLID）评分预测为“高”、“中”、“低”可配体性的蛋白质，其中不乏像WDR91和DCAF1这样已知较难寻找配体的靶点。筛选结果显示，共有118种化合物被鉴定为候选结合子（富集倍数>5），平均命中率为0.05%。这些结合子覆盖了所有高可配体性靶点、大部分中等可配体性靶点和超过一半的低可配体性靶点（图2a, b）。随后，他们使用SPR对101个候选结合子进行了正交验证，最终成功确认了16个结合子与12个靶点的结合，其K_D值范围在2至87 μM之间（图2c, d）。值得注意的是，其中12个经SPR确认的结合子属于弱亲和力结合（K_D≥ 10 μM），这凸显了E-ASMS在发现弱结合子方面的能力。研究还发现，初始E-ASMS筛选中的富集倍数与SPR测得的K_D值之间存在强相关性（图2e），提示E-ASMS读数具有半定量化的潜力。

对映选择性富集为化合物结合提供正交证据

E-ASMS方法的一个关键优势在于其利用对映选择性作为结合特异性的正交证据。在118个候选结合子中，有32个对14个靶点显示出清晰的对映选择性富集（图2c）。对于表现出对映选择性富集的更强效结合子，其SPR验证率（50%）远高于没有对映选择性的结合子（富集倍数>20时验证率为20%）（图2f）。这一趋势有力地证明了对映选择性富集在命中确认中的价值。研究人员也指出，并非所有E-ASMS候选结合子都能被SPR等生物物理方法确认，这可能与SPR所需化合物浓度较高、溶解度限制以及方法灵敏度差异有关。

对四个靶点的对映选择性结合进行深入表征

研究人员选取了四个被预测为具有“中等”或“低”可配体性的靶点——DDB1、WDR91、WDR55和HAT1——进行深入分析。对于每个靶点，他们都通过E-ASMS发现了特异性的对映选择性结合子，并通过SPR测定了亲和力，最后利用X射线晶体学解析了蛋白-配体复合物结构，从原子水平揭示了结合和对映选择性的机制。

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  DDB1: 化合物XS381952的(S)-对映体与DDB1结合（K_D= 2 μM），其效力显著高于(R)-对映体（K_D> 73 μM）。晶体结构显示，(S)-对映体通过π-堆积作用被夹在两个芳香族氨基酸残基W1047和Y1114之间，其乙氧基苯基 moiety 的朝向使其能够与DDB1的α-螺旋稳定相互作用，而(R)-对映体则因空间位阻无法适配（图3a-c）。
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  WDR91: 发现了四个结合子，其中XS838489和XS837729表现出对映选择性。晶体结构显示(R)-XS838489结合在WDR91的两个β-螺旋桨结构域之间的疏水口袋中，其酰胺氮与T547的骨架氧形成氢键，从而偏好(R)-对映体（图3d-f）。另一个结合子XS381295虽未在E-ASMS中显示出对映选择性，但其晶体结构却揭示了结合模式，后续的氢-氘（H/D）交换分析表明该化合物在手性中心可能存在快速外消旋化，从而解释了E-ASMS未能检测到对映选择性的原因。
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  WDR55: 化合物XS381774的(S)-对映体（K_D= 5 μM）结合效力比(R)-对映体（K_D> 25 μM）高至少5倍。晶体结构表明，(S)-对映体的一个甲基指向W153和I108，增强了疏水相互作用，从而解释了其对映选择性（图3g-i）。
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  HAT1: 化合物XS380871含有两个手性中心，其四个立体异构体中的两个被HAT1选择性富集。晶体结构显示该化合物结合在HAT1的乙酰辅酶A（acetyl-CoA）结合位点。其中一个手性中心的(S)-构型与G253和G249形成关键氢键，而另一个手性中心的氟苯基部分结合在一个疏水子口袋中，其构型对结合至关重要，另一个对映体因与M241周围区域发生严重空间冲突而无法结合（图3j-l）。

研究结论与意义

综上所述，这项研究成功开发并验证了E-ASMS这一新型高通量配体发现平台。其主要优势在于：1） 高灵敏度，能够有效捕获弱亲和力结合子；2） 利用对映选择性作为内置的正交验证标准，提高了结果的特异性和可靠性，有助于在早期阶段快速甄别高质量命中化合物；3） 筛选数据具有半定量潜力，可为人工智能（AI）驱动的药物发现提供高质量数据集。研究通过对31个多样化人类蛋白质的筛选，不仅发现了一系列新的弱结合配体，特别是针对传统上认为“难以配体”的靶点（如WDR55、HAT1），还通过晶体学深入揭示了其结合机制，证明了该方法的实用性和有效性。尽管E-ASMS在化合物库设计和技术操作上存在一定挑战，并且主要检测结合事件而非功能调控，但它为大规模探索人类蛋白质组的“配体空间”、加速难靶点蛋白质的化学探针和先导化合物发现提供了强大的新工具。研究人员计划到2030年将E-ASMS平台应用于约2,000种蛋白质的筛选，所有数据将共享于其建立的AIRCHECK数据库中，这将极大地推动化学生物学和药物研发领域的发展。