PKCβII通过磷酸化激活AAK1调控铁转运驱动铁死亡的新机制

《Nature Communications》：AAK1 activation-mediated iron trafficking drives ferroptotic cell death

本研究揭示了铁死亡过程中细胞铁摄取的关键调控机制。为解决铁死亡如何满足其铁需求这一科学问题，研究人员开展了PKCβII-AAK1-AP2M1信号通路调控转铁蛋白受体TFR1内吞的主题研究。结果表明PKCβII通过磷酸化AAK1的S670/T674位点，促进AP2M1磷酸化，增强TFR1的内吞和铁摄取，从而驱动铁死亡。该发现不仅阐明了铁死亡中铁代谢调控的新机制，还为癌症治疗提供了潜在靶点。

　　

细胞死亡是生命科学领域永恒的研究主题，而铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性的新型细胞死亡方式，近年来备受关注。这种死亡方式与传统的细胞凋亡不同，其核心特征是铁离子催化的脂质过氧化达到致死水平。越来越多的证据表明，铁死亡在肿瘤发生、缺血再灌注损伤和神经退行性疾病等多种病理过程中发挥着重要作用，因此成为潜在的治疗靶点。

然而，铁死亡的发生需要两个基本条件：脂质过氧化物的积累和亚铁离子（Fe²⁺）的存在。虽然科学家们对脂质过氧化物的产生和清除机制已经有了较为深入的认识，但对于细胞在铁死亡过程中如何获取足够的铁这一关键问题，仍知之甚少。特别是在铁死亡诱导时，细胞内的铁蛋白水平通常不降反升，这与预期的铁蛋白降解增加相矛盾，暗示细胞可能主要通过从外界摄取铁来满足铁死亡的需求。

在这项发表于《Nature Communications》的重要研究中，Li-Chao Li、Zhi-Peng Ye、Ying Xiao等研究人员揭开了这一谜团。他们发现了一条名为PKCβII-AAK1-AP2M1的全新信号通路，该通路在铁死亡过程中负责调控细胞对铁的"采购"工作，如同一个精密的物流系统，确保铁死亡能够顺利执行。

研究人员主要运用了基因编辑技术（CRISPR-Cas9）构建基因敲除细胞系，通过磷酸化蛋白质组学分析筛选关键靶点，利用体外激酶实验验证直接磷酸化关系，并建立了裸鼠移植瘤模型进行体内功能验证。临床样本分析基于TCGA数据库和包含217例三阴性乳腺癌患者的组织芯片。

PKCβII促进TFR1的内吞和铁摄取

研究人员首先确认了在铁死亡过程中，细胞确实通过增强转铁蛋白受体1（TFR1）的内吞作用来获取更多的铁。有趣的是，他们发现这一过程依赖于蛋白激酶CβII（PKCβII）的活性。当研究人员敲除PKCβII基因后，细胞表面滞留了更多的TFR1，表明其内吞过程受阻，同时细胞内的总铁和亚铁离子水平也显著下降。进一步实验证明，只有PKCβII而非其同工酶PKCβI能够恢复TFR1的内吞功能。

PKCβII通过相互作用激活AAK1

为了探究PKCβII调控TFR1内吞的具体机制，研究人员通过磷酸化蛋白质组学分析发现，AP2相关蛋白激酶1（AAK1）可能是PKCβII的下游靶点。AAK1是一种已知能够促进网格蛋白介导的内吞作用的激酶。实验证实，PKCβII与AAK1在铁死亡过程中直接相互作用，并且这种相互作用随着铁死亡诱导剂浓度的增加而增强。当使用PKC抑制剂或敲除PKCβII时，AAK1的磷酸化水平显著降低。

AAK1的S670/T674位点磷酸化是关键

研究人员通过精细的突变实验确定，PKCβII直接磷酸化AAK1的第670位丝氨酸（S670）和第674位苏氨酸（T674）这两个关键位点。只有当这两个位点被模拟磷酸化突变（突变为谷氨酸）时，AAK1才能恢复其在铁死亡中的功能；而非磷酸化突变（突变为丙氨酸）则无此效果。研究人员还开发了特异性识别p-AAK1(S670/T674)的抗体，直接证实了在铁死亡过程中AAK1确实在这两个位点被磷酸化。

PKCβII-AAK1-AP2M1通路完整性的验证

AAK1的主要功能是磷酸化AP2复合物的μ亚基（AP2M1）的第156位苏氨酸（T156），从而促进网格蛋白的招募和 cargo 膜蛋白的内吞。研究人员发现，在铁死亡过程中，AP2M1的磷酸化水平确实升高，且这一过程依赖于PKCβII和AAK1的活性。更重要的是，只有当AP2M1的T156位点被模拟磷酸化突变时，才能恢复在AP2M1敲除细胞中受损的TFR1内吞功能。

该通路显著增强对铁死亡的敏感性

功能实验表明，干扰PKCβII-AAK1-AP2M1通路中的任何一个环节，都会使细胞对铁死亡诱导剂产生抵抗，脂质过氧化水平也相应降低。相反，激活这一通路则会增强细胞对铁死亡的敏感性。在动物实验中，AAK1敲除的肿瘤细胞在裸鼠体内生长更快，且对铁死亡诱导剂不敏感，而重新引入野生型AAK1（而非S670/T674Ala突变体）则能恢复肿瘤对铁死亡的敏感性。

临床意义和治疗前景

临床数据分析显示，PKCβII-AAK1-AP2M1通路的高表达与乳腺癌患者更好的预后相关。在三阴性乳腺癌组织芯片中，PKCβII的表达与AAK1的磷酸化水平以及脂质过氧化标志物4-HNE的含量呈正相关。此外，研究人员还发现AAK1能够增强肿瘤对放射治疗的敏感性，因为放疗已知可诱导铁死亡。

这项研究不仅揭示了铁死亡过程中细胞铁摄取的关键调控机制，还发现了PKCβII在铁死亡中的双重角色：既作为脂质过氧化的传感器，又作为铁摄取的协调者。这种协同机制确保了铁死亡过程中脂质过氧化和铁供应之间的精密平衡，为理解铁死亡的执行机制提供了全新视角。

从治疗角度看，靶向PKCβII-AAK1-AP2M1通路可能为诱导肿瘤细胞铁死亡提供新的策略，特别是在传统治疗方法效果有限的三阴性乳腺癌等恶性肿瘤中。这项研究为开发通过调控铁死亡来治疗癌症的新方法奠定了重要理论基础。