单细胞多组学整合框架重构表观基因组动态，揭示转录激活的时序调控机制

《Nature Communications》：Reconstructing epigenomic dynamics through a single-cell multi-epigenome data integration framework

转录调控由多种调控因子在基因组DNA上的动态组合作用决定，但其在单个基因位点的精确结合顺序尚不清楚。本研究开发了一种单细胞数据整合框架sci-mtChIL-seq，通过以RNAPII（RNA聚合酶II）结合位点为基础，整合多个单细胞多表观基因组数据集，系统性地揭示了转录因子、组蛋白修饰和染色质重塑在转录激活过程中的时序协调性。该研究为揭示复杂细胞系统中基因调控的普适性原则提供了强大的方法学工具。

　　

论文解读

研究背景

细胞状态的改变，无论是源于分化信号、衰老还是外界应激，其根本驱动力都是基因表达的改变。而基因表达又受到表观基因组状态的严格调控，这包括染色质结构和高级基因组组织。尽管科学家们已经鉴定出许多表观基因组调控因子，但这些因子如何协同作用，以动态、组合的方式在单个基因位点聚集并最终激活转录，其精确顺序仍然是一个巨大的“黑箱”。

目前，解决这一挑战主要有两种策略。一种是技术上的“硬”突破，即开发能够同时分析更多因子的方法。然而，随着分析靶点数量的增加，每个靶点的测序深度会降低，且共定位因子之间的物理干扰会带来根本性的技术限制。另一种是计算上的“软”整合，即通过算法将不同来源的数据集整合在一起，进行“虚拟”的多因子评估。然而，这种方法主要依赖于转录水平进行整合，难以直接揭示染色质因子在DNA上的结合动态。

为了填补这一空白，研究人员亟需一种能够同时捕获转录状态变化和多种表观基因组因子积累模式的新方法，从而在单细胞水平上重建转录调控的动态过程。

研究方法

为了回答上述问题，研究团队开发了一个名为sci-mtChIL-seq（单细胞多重靶点染色质整合标记测序）的技术平台。该技术基于团队此前开发的ChIL-seq方法，通过结合split-and-pool（拆分与合并）策略，实现了在单细胞水平上同时分析RNAPII（RNA聚合酶II）和多种表观基因组因子（如组蛋白修饰、转录因子）的全基因组结合情况。

研究团队首先在体外细胞模型（NIH3T3细胞诱导的肌生成分化模型）中应用该技术，分析了RNAPII与Brg1、H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3、MyoD和Myog等因子的组合。随后，为了验证该技术的体内适用性，研究团队还收集了小鼠胚胎发育早期（E10.5至E14.5）的躯干和肢体组织，进行了单细胞多表观基因组分析。

研究结果

1. 开发并验证sci-ChIL-seq方法

研究团队首先开发了sci-ChIL-seq方法，用于单细胞水平分析单个因子的结合状态。该方法通过Tn5转座酶介导的整合反应，将带有独特索引序列的ChIL探针引入到靶点附近，并结合split-and-pool策略进行细胞条形码标记，实现了高通量的单细胞分析。在NIH3T3细胞中，sci-ChIL-seq获得的RNAPII和H3K4me3信号与基因表达水平呈正相关，且单细胞水平的信号模式具有高度可重复性，证明了该方法能够以单细胞分辨率可靠地检测因子特异性的染色质景观。

2. 实现sci-mtChIL-seq的多靶点同时分析

研究团队进一步将sci-ChIL-seq扩展为多靶点格式，开发了sci-mtChIL-seq。在同时分析RNAPII和H3K4me3的实验中，该方法获得的信号与单靶点sci-ChIL-seq结果高度相关，且单细胞信号模式一致，证明了sci-mtChIL-seq能够实现与单靶点方法几乎等效的性能，从而在单细胞分辨率下进行双因子定位分析。

3. 肌生成过程中sci-mtChIL-seq数据的整合分析

利用sci-mtChIL-seq技术，研究团队分析了MyoD依赖的骨骼肌分化模型。通过以RNAPII数据为基础进行数据整合，研究人员成功地将不同时间点的细胞投射到一个共享空间中，并识别出与分化过程相关的细胞亚群。这些亚群包括未分化增殖细胞、成纤维细胞样细胞、成肌细胞样分化细胞以及分化过程中的细胞。通过分析这些亚群中表观基因组因子的积累水平，研究人员发现，激活相关的因子（如Brg1、H3K4me3、H3K27ac）在差异表达基因上积累增加，而抑制性因子H3K27me3则表现出与激活标记相反的信号分布。

4. 单细胞水平转录因子动态分析

为了阐明转录因子在骨骼肌分化过程中的动态变化，研究团队整合了RNAPII-MyoD和RNAPII-Myog的sci-mtChIL-seq数据。通过推断伪时间轨迹，研究人员分析了MyoD和Myog在分化过程中的结合动态。结果显示，MyoD的结合在分化早期即出现，并随着分化进程呈现出复杂的动态模式，包括单调递减、单调递增、晚期增加和瞬时增加等。而Myog的结合则主要在分化后期显著增加，且大部分峰位点呈现出单调递增的趋势。基因本体富集分析表明，MyoD在分化早期诱导肌生成程序，而Myog则主要调控骨骼肌形成相关基因的表达。

5. 整合sci-mtChIL-seq数据的组合分析

为了研究多个表观基因组因子如何协同调控单个基因位点的转录，研究团队开发了一个名为“表观基因组轨迹”的分析框架。该框架通过整合多个sci-mtChIL-seq数据集，推断出因子结合事件的调控顺序。以骨骼肌特异性基因Mef2a为例，分析结果显示，其调控顺序依次为：Brg1和H3K27ac在增强子区域的积累、MyoD在启动子区域的结合、H3K4me3的积累、Myog的结合，最后是RNAPII的延伸。这一结果支持了MyoD在增强子和启动子处结合，促进活性染色质结构形成，随后招募Myog和RNAPII的调控模型。

研究结论与意义

本研究开发了一个通过整合单细胞多表观基因组数据来推断转录调控机制的综合框架。该框架的核心是sci-mtChIL-seq技术，它能够在单细胞水平上对DNA结合蛋白和表观基因组因子进行高分辨率分析。通过以RNAPII为基础的数据整合，该研究不仅捕获了全基因组和位点特异性的染色质动态，还揭示了转录激活过程中多个因子在时间上的协调性。

研究结果表明，MyoD在染色质重塑中发挥起始作用，随后招募Myog并激活RNAPII，这一过程在时间上是协调进行的。MyoD结合时间的可变性提示了一种调控转录启动的机制，而其对非肌基因的选择性结合则暗示了由辅因子介导的、依赖于细胞背景的抑制机制的存在。

该研究提出的数据整合框架代表了单细胞表观基因组学领域的一项重要进展，为研究转录因子和染色质修饰因子如何协调基因表达提供了一个通用且可扩展的工具，为在复杂系统中解析细胞命运决定和动态调控机制开辟了新的途径。