支持细胞通过Gasdermin D依赖性信号环路协同调控噪声性听力损失

《Nature Communications》：Supporting cells orchestrate noise-induced hearing loss via a Gasdermin D-dependent signaling loop with hair cells

本研究针对噪声性听力损失（NIHL）的传统认知局限，创新性地揭示了支持细胞（SCs）通过Gasdermin D（GSDMD）激活在听力损失中的核心作用。研究人员发现，噪声诱导的毛细胞（HCs）氧化应激通过EGFR/ERK通路激活支持细胞中的caspase-11依赖性GSDMD剪切，进而形成HCs与SCs之间的致病性正反馈环路。该研究不仅确立了支持细胞作为NIHL的新型信号枢纽，更为靶向GSDMD介导的细胞间通讯治疗策略提供了理论依据。

　　

当我们身处喧嚣环境时，巨大的声响不仅会带来暂时的不适，更可能对听觉系统造成永久性损伤。噪声性听力损失（Noise-induced hearing loss, NIHL）作为最常见的获得性感音神经性听力损失，长期以来被认为主要源于对声音感知的关键细胞——毛细胞（Hair Cells, HCs）的直接机械性和代谢性损伤。尽管氧化损伤和炎症已被确认为耳蜗损伤的核心介质，但这两个过程如何相互作用以决定毛细胞命运，以及耳蜗内其他细胞类型是否参与这一过程，仍是未解之谜。

传统观点将研究焦点集中于毛细胞本身，而忽视了其周围的支持细胞（Supporting Cells, SCs）可能发挥的作用。支持细胞作为耳蜗内重要的结构支撑细胞，在NIHL发病机制中的作用尚未被充分探索。特别是Gasdermin D（GSDMD）——这一炎症细胞死亡的关键执行者——在耳蜗内的表达模式、激活机制及其在NIHL中的具体功能，构成了本研究探索的核心科学问题。

发表在《Nature Communications》的这项研究颠覆了我们对NIHL发病机制的传统认知。研究团队发现，支持细胞而非毛细胞，通过GSDMD的激活，在噪声性听力损失中扮演着 orchestrator（协调者）的角色。他们揭示了一个全新的致病机制：噪声暴露导致毛细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）积累，进而通过激活支持细胞中的表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）/细胞外信号调节激酶（Extracellular-regulated Kinase, ERK）通路，触发caspase-11依赖的GSDMD剪切。激活的GSDMD又反过来加剧毛细胞的氧化损伤，从而在两种细胞类型之间建立了一个自我强化的致病性正反馈环路。

为开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术方法：通过听觉脑干反应（Auditory Brainstem Response, ABR）和畸变产物耳声发射（Distortion Product Otoacoustic Emissions, DPOAE）评估听力功能；利用免疫荧光染色和免疫组化进行蛋白定位和表达分析；采用蛋白质印迹法（Western Blotting, WB）检测蛋白表达和活化水平；通过腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）载体实现细胞类型特异性基因操作（包括条件性基因敲除和过表达）；使用多种基因工程小鼠（包括全身性敲除、条件性敲除和双基因敲除小鼠）进行功能验证；并通过药理学方法（使用抑制剂如disulfiram、Zorifertinib、dabrafenib等）干预特定信号通路。实验所用小鼠均为C57BL/6背景，部分基因工程小鼠由合作单位馈赠。

Gsdmd全局敲除（KO）可减轻小鼠NIHL

研究人员首先通过蛋白质印迹验证了Gsdmd KO小鼠耳蜗组织中GSDMD的敲除效率。免疫组化和免疫荧光染色结果一致表明，GSDMD主要定位于 Corti器内的支持细胞，特别是柱细胞和 Claudius细胞，而在毛细胞中表达极低。

听觉脑干反应测试显示，6周大的Gsdmd KO小鼠与野生型（Wild-Type, WT）小鼠的基础听力阈值无显著差异，表明GSDMD缺陷不影响正常听觉功能。暴露于100 dB SPL的倍频程噪声（8-16 kHz）2小时后，Gsdmd KO小鼠在噪声暴露后14天（14 d-PNE）于16、22.6和32 kHz频率处的ABR阈值偏移显著小于WT对照组。

支持细胞而非毛细胞中的Gsdmd条件性敲除（cKO）可减轻声损伤

为确定Gsdmd KO的保护作用是否具有支持细胞特异性，研究人员使用对支持细胞具有高转染效率的AAV-ie血清型病毒，在Gsdmd flox/flox小鼠中实现了支持细胞条件性敲除（SC-cKO）。

在噪声挑战下，SC-cKO小鼠表现出噪声诱导阈值偏移的显著降低，外毛细胞（Outer Hair Cells, OHCs）损失近乎完全消除，并且DPOAE阈值在14 d-PNE时显著恢复。值得注意的是，SC-cKO小鼠OHC损失的减少程度比全局KO小鼠更为显著，提示非支持细胞中的GSDMD可能在声损伤中发挥相反（可能为保护性）作用。此外，无论是Gsdmd-KO还是SC-cKO小鼠，对耳蜗突触计数均未显示出保护作用。相反，利用对毛细胞具有高转染效率的AAV.PHP.eB血清型病毒构建的毛细胞条件性敲除（HC-cKO）小鼠，在相同噪声暴露后，未观察到ABR阈值偏移、OHC损失或突触损失方面的保护效应。

GSDMD在噪声暴露后通过caspase-11依赖性通路被激活

GSDMD的激活通常涉及其N端片段（GSDMD-N）的蛋白水解剪切，该片段有助于在细胞膜上形成孔洞，导致炎症性细胞损伤。蛋白质印迹分析显示，在噪声暴露后8小时（8 h-PNE），耳蜗GSDMD-N水平开始显著增加，并持续至7天。使用FDA批准的药物disulfiram（抑制GSDMD-N孔洞形成）进行干预，可部分减轻噪声诱导的听力功能障碍，提示GSDMD介导的孔洞形成在耳蜗损伤中发挥作用。

GSDMD激活根本上依赖于半胱天冬酶（caspases）介导的蛋白水解剪切。使用caspase-1和caspase-11双基因敲除（Casp1/11 DKO）小鼠，研究人员观察到噪声暴露后GSDMD-N水平较WT对照组显著降低。尽管caspase-1在IL-1β成熟中起关键作用，但其在GSDMD剪切中的作用被排除，因为Casp1 KO小鼠耳蜗在噪声暴露后GSDMD-N升高水平与WT相当。Casp11 KO小鼠则表现出噪声暴露后GSDMD-N和切割的IL-1β水平较WT对照组显著降低，这证实caspase-11是声创伤后耳蜗GSDMD水解剪切的主要介质，并且是caspase-1依赖性炎症的上游调控因子。

氧化损伤驱动耳蜗GSDMD激活

研究揭示了噪声暴露后耳蜗内氧化应激标志物4-羟基壬烯醛（4-Hydroxynonenal, 4-HNE）与GSDMD-N水平随时间变化的密切关系，两者呈显著正相关（Pearson r=0.917）。使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）处理，可显著降低噪声诱导的切割caspase-11、caspase-1和GSDMD-N水平，表明caspase-11激活发生于GSDMD剪切的上游。

GSDMD通过自我强化的细胞间环路加剧毛细胞的氧化损伤

GSDMD激活后，又能反向放大毛细胞的氧化损伤。Gsdmd KO小鼠在噪声暴露后耳蜗整体4-HNE水平显著降低，切割的caspase-11/caspase-1/IL-1β近乎完全消除。空间分析进一步证实，Gsdmd KO小鼠的OHCs中4-HNE积累特异性减弱。重要的是，Gsdmd-SC-cKO同样降低了耳蜗整体4-HNE水平以及OHCs的4-HNE荧光强度。这些结果确立了支持细胞中GSDMD激活可放大毛细胞的氧化损伤，定义了一个从支持细胞到毛细胞的细胞间反馈环路。

GPX4（而非GPX1）功能障碍启动ROS-GSDMD反馈环路形成

谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase, GPX）系统是控制活性氧（ROS）的关键抗氧化酶家族。研究发现，噪声暴露后2小时（2 h-PNE），耳蜗中GPX4（而非GPX1）水平出现瞬时性降低。在耳蜗中过表达GPX4（而非GPX1）能显著减轻噪声诱导的阈值偏移，更好地保留DPOAE，减少OHC损失和突触损失，并显著降低噪声诱导的GSDMD-N和4-HNE积累。这些结果表明GPX4过表达可部分破坏氧化应激-GSDMD反馈环路。此外，2 h-PNE时GPX4的下调不能被GSDMD敲除所缓解，表明GPX4缺陷增强了氧化应激及其与GSDMD的反馈环路。

仅在毛细胞中减轻氧化损伤足以阻断GSDMD相关信号传导

利用AAV.PHP.eB载体在毛细胞中特异性过表达Gpx4（AAV-HC-Gpx4），结果显示，与对照组相比，AAV-HC-Gpx4组噪声诱导的GSDMD-N、切割caspase-11、切割caspase-1、切割IL-1β以及4HNE水平均降低。尽管GSDMD主要表达并功能于支持细胞，但仅在毛细胞（而非支持细胞）中过表达GPX4，就足以减轻耳蜗氧化应激和GSDMD激活，这提示毛细胞和支持细胞之间存在细胞间通讯。

EGFR/ERK维持噪声诱导的ROS-GSDMD环路在毛细胞和支持细胞间运行

毛细胞和支持细胞间的通讯可能通过膜受体实现。研究排除了Toll样受体4（Toll-like Receptor 4, TLR4）作为噪声诱导GSDMD激活的主要介质。相反，FDA批准的EGFR抑制剂Zorifertinib能显著降低噪声诱导的小鼠耳蜗4HNE和GSDMD-N水平。EGFR主要定位于支持细胞，其激活可触发下游ERK磷酸化（p-ERK）。免疫荧光分析显示，噪声暴露后耳蜗支持细胞（而非毛细胞）中p-ERK水平升高。药理学抑制p-ERK上游信号（使用dabrafenib）或直接抑制ERK（使用ASNO07）均能降低噪声诱导的GSDMD-N和4HNE水平。更重要的是，在毛细胞中过表达Gpx4（通过AAV-HC-Gpx4转染）可降低噪声暴露后支持细胞中的p-ERK水平。这些发现表明，毛细胞中的氧化应激通过跨越支持细胞膜的EGFR-ERK信号，启动了耳蜗ROS-GSDMD反馈环路。

本研究结论与讨论部分深刻阐述了其科学意义。研究确认，支持细胞特异性（而非毛细胞特异性）的Gsdmd条件性敲除可显著减轻噪声暴露引起的听力阈值升高和外毛细胞损失，而阻断caspase-11依赖的GSDMD激活几乎完全消除了对毛细胞的氧化应激损伤。反之，特异性在毛细胞中减轻氧化应激（通过Gpx4过表达）可通过支持细胞膜的EGFR信号传导，降低支持细胞中的ERK磷酸化，进而抑制GSDMD激活。基于这些发现，研究者提出了一个概念框架：毛细胞中初始的ROS积累触发了支持细胞中的GSDMD激活，而激活的GSDMD又反过来加剧毛细胞的氧化损伤，形成一个致病性正反馈环路。破坏此反馈环路可能成为预防听力功能障碍的有效基因治疗策略。

该研究的重要创新在于将支持细胞确立为NIHL的主动信号枢纽，并识别GSDMD作为毛细胞与支持细胞之间致病性正反馈环路的核心介质。研究揭示了caspase-11（而非caspase-1）是声创伤后耳蜗GSDMD剪切的关键执行者，并明确了EGFR/ERK通路在介导细胞间通讯中的关键作用。同时，研究也指出了功能的复杂性，例如全局Gsdmd KO的保护效果弱于支持细胞特异性敲除，提示GSDMD在非支持细胞（如巨噬细胞）中可能发挥保护性作用，这强调了细胞特异性靶向治疗的重要性。对于GSDMD激活后如何具体信号反馈至毛细胞以加剧其氧化应激和死亡，以及其活性是否源于特定支持细胞亚型等问题，仍需未来研究深入阐明。总之，该研究建立了理解NIHL机制的新概念框架，并为靶向ROS-GSDMD反馈环路的治疗策略开发奠定了基础。