AAV递送的工程化抑制性tRNA通过无义突变通读策略挽救遗传性视网膜病变小鼠的视觉功能

《Nature Communications》：AAV-delivered engineered suppressor tRNA rescues visual function in mice with an inherited retinal disease

本研究针对由无义突变（premature termination codon, PTC）导致的遗传性视网膜疾病（inherited retinal diseases, IRDs），开发了一种基于腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）递送的工程化抑制性tRNAArg（sup-tRNAArg）治疗策略。研究人员通过理性设计tRNA体序列（body sequence），显著提升了其对RPE65基因R44X无义突变的通读效率，在rd12小鼠模型中成功恢复了约50.2%的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞的RPE65蛋白表达，并有效改善了小鼠的光感受器功能及视觉引导行为，且疗效可持续至少36周。该研究为IRDs的基因治疗提供了新型安全有效的解决方案。

　　

在遗传性视网膜疾病（inherited retinal diseases, IRDs）的研究领域，无义突变（nonsense mutation）是导致疾病的重要原因之一，约占所有致病突变的18.5%。这类突变会将正常的氨基酸密码子转变为提前终止密码子（premature termination codon, PTC），使得对应的mRNA无法翻译出完整长度的功能蛋白，并常常激活无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）通路，最终引起视网膜细胞的功能丧失与退化。传统的小分子通读药物虽有一定疗效，但存在氨基酸插入随机、脱靶效应以及长期使用毒性等问题，限制了其临床应用。近年来，基因治疗技术，尤其是基于腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）的递送系统，为这类疾病的治疗带来了新希望。然而，对于像ABCA4这样的大基因（其致病突变约占IRDs的24.8%），其编码序列长度超过了AAV的包装容量限制。此外，长期随访研究表明，接受RPE65基因替代治疗的患者仍会出现持续的光感受器丢失和视力改善后的逐渐下降。CRISPR基因编辑技术虽然前景广阔，但其较大的尺寸、潜在的免疫原性以及体内递送效率等问题仍是巨大挑战。因此，开发一种能够高效、精准、安全地纠正无义突变的新型治疗策略迫在眉睫。

在这一背景下，抑制性tRNA（suppressor tRNA, sup-tRNA）技术展现出独特优势。该技术通过改造tRNA的反密码子，使其能够识别PTC并插入相应的氨基酸，从而恢复全长蛋白的翻译。与基因替代疗法不同，sup-tRNA恢复的蛋白表达源于内源性转录本，理论上更符合生理调控。然而，尽管在细胞模型中效果显著，sup-tRNA在体内的递送效率、稳定性和安全性仍是其走向临床应用的瓶颈。

为了克服这些挑战，任成达、宋丽、胡明等研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们聚焦于由精氨酸tRNA（tRNA^Arg）改造而来的sup-tRNA，旨在高效通读临床相关的UGA型PTC（如RPE65基因的R44X突变和ABCA4基因的R681X突变）。研究团队没有止步于简单的反密码子替换，而是对tRNA的体序列进行了深入的理性设计优化。他们从与UGA密码子近乎同源（near-cognate）的天然人源tRNA^Arg同解码器（isodecoder）入手，通过体外双荧光素酶报告系统和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告系统进行初步筛选，鉴定出效率最高的sup-tRNA^Arg-TCT-1。随后，他们借鉴前人关于tRNA体序列，特别是TΨC茎（TΨC-stem）和反密码子茎（anticodon-stem）对tRNA稳定性和解码效率影响的研究，对TCT-1进行了定点突变优化。最终获得的优化变体sup-tRNA^Arg-A4T1（简称A4T1）在体外实验中，其对RPE65-R44X无义突变的通读效率达到了TCT-1的2.2倍，能够恢复72.3%的全长RPE65蛋白表达，并且能够有效抑制NMD通路，稳定突变mRNA的水平。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：利用双荧光素酶报告系统和流式细胞术进行体外sup-tRNA通读效率的高通量筛选；通过蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光技术检测全长蛋白的恢复情况；运用定量PCR（qPCR）和液滴数字PCR（ddPCR）分析mRNA水平的稳定性；构建自互补型AAV8（scAAV8）载体用于体内sup-tRNA的递送；通过视网膜电图（electroretinography, ERG）评估小鼠视网膜功能；利用视觉悬崖测试（visual cliff test）和莫里斯水迷宫（Morris water maze）行为学实验评估视觉引导行为；通过苏木精-伊红（H&E）染色观察视网膜结构；采用RNA测序（RNA-seq）和核糖体图谱（ribosome profiling）技术全面评估治疗的转录组安全性和对天然终止密码子（native termination codon, NTC）通读的影响。研究中使用的rd12小鼠模型是携带RPE65基因p.R44X纯合无义突变的遗传性视网膜病变模型。

scAAV8.sup-tRNA^Arg在体内抑制RPE65-R44X无义突变

为了评估序列工程策略在活体内的有效性，研究团队将携带sup-tRNA^Arg-TCT-1或sup-tRNA^Arg-A4T1的scAAV8载体通过视网膜下注射的方式递送到2周龄rd12小鼠眼中。结果表明，两种载体均能剂量依赖性地提高小鼠暗视和明视ERG的a波和b波振幅，且scAAV8.A4T1在相同剂量下表现出更优的效果。蛋白质印迹分析显示，scAAV8.A4T1处理的小鼠眼内RPE65蛋白表达恢复至野生型水平的16.4%。免疫荧光染色进一步证实，scAAV8.A4T1处理的眼睛中，平均有36.0%的RPE细胞呈现RPE65阳性，而scAAV8.TCT-1组仅为4.5%。液滴数字PCR结果显示，scAAV8.A4T1能有效稳定RPE65-R44X mRNA的表达水平，使其接近RPE65-R44的水平，这与其抑制NMD的能力相关。

scAAV8.A4T1挽救rd12小鼠的视网膜功能

在长期疗效评估中，注射了1x10? GC/眼剂量的scAAV8.A4T1或scAAV8.TCT-1的小鼠被持续观察。ERG结果显示，scAAV8.A4T1治疗显著提高了小鼠对不同强度闪光刺激的反应。具体而言，scAAV8.A4T1治疗挽救了暗视ERG中a波和b波振幅的21.3%和35.6%，以及明视ERG中a波和b波振幅的83.0%和76.9%。由于rd12小鼠存在早期视锥细胞退化，明视ERG的显著改善可能源于治疗延长了视锥细胞的存活。对视网膜平片进行花生凝集素（PNA-lectin）和M-视蛋白（M-opsin）染色发现，scAAV8.A4T1治疗组小鼠视网膜中M-视蛋白阳性区域占比达到81.8%，显著高于未治疗组（34.2%）和scAAV8.TCT-1组（45.7%）。同时，scAAV8.A4T1治疗组视网膜中PNA-lectin阳性的存活视锥细胞数量也远高于其他组。

scAAV8.A4T1恢复rd12小鼠的视觉引导行为

为了检验视网膜功能的改善是否转化为视觉行为的提升，研究人员进行了视觉悬崖测试和改良版莫里斯水迷宫测试。在视觉悬崖选择偏好测试中，scAAV8.A4T1治疗组小鼠选择安全区的成功率（46.2%）显著高于未治疗组（23.3%），且做出选择的时间更短。在开放场测试中，scAAV8.A4T1治疗组小鼠在危险区累计停留时间（81.8秒）显著短于未治疗组（154.5秒）和scAAV8.TCT-1组（132.2秒），其活动路径与野生型小鼠相似，表明其区分安全区与危险区的能力真实改善。在依赖视力的水迷宫测试中，scAAV8.A4T1治疗组小鼠定位平台的成功率（79.2%）和逃避潜伏期均显著优于未治疗组，进一步证实了其视觉功能的恢复。

scAAV8.sup-tRNA^Arg治疗在小鼠体内的安全性与长期评价

安全性评估显示，视网膜下注射scAAV8.sup-tRNA^Arg未引起明显的视网膜结构紊乱，外核层（outer nuclear layer, ONL）厚度在治疗12周后无显著变化。RNA测序分析发现，与未治疗的rd12小鼠相比，scAAV8.A4T1治疗组小鼠的RPE/脉络膜/巩膜复合体中仅有26个转录本上调，178个下调。上调基因主要富集在视觉感知和眼睛发育相关通路，而下调基因则与免疫反应相关，提示治疗可能缓解了因RPE65缺失引起的炎症。更重要的是，与已知的1000个人类推定的NMD底物集进行比较，scAAV8.A4T1并未引起内源性NMD底物的普遍上调，表明其没有导致全局性的UGA通读。内质网应激（UPR）通路相关基因的表达也未发生显著改变。核糖体图谱分析进一步证实，scAAV8.A4T1和scAAV8.TCT-1均未在天然终止密码子（NTC）处诱导显著的核糖体通读，这与氨基糖苷类药物G418引起的广泛通读形成鲜明对比。在长达36周的随访中，治疗组ONL厚度的下降速度略慢于未治疗组，RPE65蛋白表达水平和ERG反应振幅保持相对稳定，证明了scAAV8.A4T1治疗的长期安全性和有效性。

本研究通过概念验证，充分展示了工程化sup-tRNA^Arg在治疗由无义突变引起的遗传性视网膜疾病方面的巨大潜力。研究人员不仅筛选出高效的sup-tRNA^Arg-TCT-1，更通过对其体序列的理性工程化改造，获得了性能大幅优化的A4T1变体。利用scAAV递送平台，该策略成功地在rd12小鼠模型中恢复了视网膜功能和行为视力，且未观察到显著毒性，为治疗由RPE65基因无义突变导致的IRDs提供了一种极具前景的新型治疗选择。该策略的优势在于其不依赖于特定基因的替代，且能利用内源性转录本进行蛋白表达调控，同时避免了CRISPR基因编辑可能存在的永久性基因组改变风险。虽然TΨC茎工程化策略对精氨酸tRNA效果显著，但其普适性仍需在其他氨基酸类型的sup-tRNA上进一步验证。眼部的解剖可及性和免疫豁免特性使其成为基因治疗的理想靶点。该研究为sup-tRNA疗法在更广泛的遗传病领域的应用奠定了坚实的基础，标志着无义突变通读治疗策略向前迈出了关键一步。