高通量多重 qPCR 技术用于区分沙门氏菌血清型 Heidelberg、Enteritidis、Typhimurium、Gallinarum 和 Pullorum
《Brazilian Journal of Microbiology》：High-throughput multiplex qPCR for distinguishing Salmonella serovars Heidelberg, Enteritidis, Typhimurium, Gallinarum, and Pullorum
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建立可同时检测禽类沙门氏菌四血清型和Heidelberg血清型的多重qPCR方法，优化引物浓度至0.10 μM和探针浓度0.05 μM，检测限Cq值33.39，在21份Heidelberg菌株和41份自然污染样本中均实现准确检测。
摘要
根据巴西国家《沙门氏菌》控制计划的规定，商业肉鸡和火鸡养殖场必须对Enteritidis、Typhimurium、Gallinarum和Pullorum血清型进行监测。然而，最近在禽类产品中发现的Heidelberg血清型沙门氏菌引发了人们对其他血清型传播的新担忧。在此背景下，本研究旨在标准化一种多重qPCR检测方法，该方法能够同时区分这四种受监管的血清型以及Heidelberg血清型沙门氏菌，从而优化检测灵敏度和分析速度，有效应对当前家禽生产中的卫生挑战。沙门氏菌分离株来自Servi?o de Orienta??o à Alimenta??o Pública (SOAP)、Servi?o de Ornitopatologia FMVZ/UNESP的微生物收藏库以及SOAP的常规实验室。细菌基因组DNA采用基于磁珠的内部协议进行纯化，通过针对invA基因保守区域的实时PCR（qPCR）进行沙门氏菌属水平的检测。对于多重检测，根据先前的标准化方法使用了针对每种受监管血清型的特异性引物和探针；而针对Heidelberg血清型的探针则是通过计算机模拟设计并在本研究中进行了实验验证。多重qPCR反应通过五种不同的引物浓度（0.05–0.30 μM）和探针浓度（0.05–0.15 μM）组合进行了优化。检测限是通过基因组DNA的系列稀释建立的，并在21株已分型的Heidelberg血清型沙门氏菌菌株上进行了验证，随后在41株来自自然污染样本的沙门氏菌分离株上进行了评估。所有测试条件均能一致地扩增出Heidelberg血清型沙门氏菌；其中，引物浓度为0.10 μM、探针浓度为0.05 μM的组合被确定为最稳定的方案。检测限（LOD）被定义为最大Cq值为33.39。使用标准化的多重检测方法对21株已分型的Heidelberg血清型沙门氏菌菌株进行检测时，Cq值范围为16.03至27.06（平均值=18.55；中位数=17.36；标准差=2.79）。在41株来自自然污染样本的沙门氏菌分离株中，有4株显示出Heidelberg血清型的扩增，其Cq值分别为18.04、17.60、16.00和16.61。标准化的多重qPCR检测方法能够一致地检测出Heidelberg血清型沙门氏菌及受监管的血清型。这种快速、可靠且灵活的诊断方法满足了家禽行业对准确、及时检测的需求，有助于早期监测新出现的血清型（如Heidelberg血清型），并支持主动监测和风险缓解措施。
根据巴西国家《沙门氏菌》控制计划的规定，商业肉鸡和火鸡养殖场必须对Enteritidis、Typhimurium、Gallinarum和Pullorum血清型进行监测。然而，最近在禽类产品中发现的Heidelberg血清型沙门氏菌引发了人们对其他血清型传播的新担忧。在此背景下，本研究旨在标准化一种多重qPCR检测方法，该方法能够同时区分这四种受监管的血清型以及Heidelberg血清型沙门氏菌，从而优化检测灵敏度和分析速度，有效应对当前家禽生产中的卫生挑战。沙门氏菌分离株来自Servi?o de Orienta??o à Alimenta??o Pública (SOAP)、Servi?o de Ornitopatologia FMVZ/UNESP的微生物收藏库以及SOAP的常规实验室。细菌基因组DNA采用基于磁珠的内部协议进行纯化，通过针对invA基因保守区域的实时PCR（qPCR）进行沙门氏菌属水平的检测。对于多重检测，根据先前的标准化方法使用了针对每种受监管血清型的特异性引物和探针；而针对Heidelberg血清型的探针则是通过计算机模拟设计并在本研究中进行了实验验证。多重qPCR反应通过五种不同的引物浓度（0.05–0.30 μM）和探针浓度（0.05–0.15 μM）组合进行了优化。检测限是通过基因组DNA的系列稀释建立的，并在21株已分型的Heidelberg血清型沙门氏菌菌株上进行了验证，随后在41株来自自然污染样本的沙门氏菌分离株上进行了评估。所有测试条件均能一致地扩增出Heidelberg血清型沙门氏菌；其中，引物浓度为0.10 μM、探针浓度为0.05 μM的组合被确定为最稳定的方案。检测限（LOD）被定义为最大Cq值为33.39。使用标准化的多重检测方法对21株已分型的Heidelberg血清型沙门氏菌菌株进行检测时，Cq值范围为16.03至27.06（平均值=18.55；中位数=17.36；标准差=2.79）。在41株来自自然污染样本的沙门氏菌分离株中，有4株显示出Heidelberg血清型的扩增，其Cq值分别为18.04、17.60、16.00和16.61。标准化的多重qPCR检测方法能够一致地检测出Heidelberg血清型沙门氏菌及受监管的血清型。这种快速、可靠且灵活的诊断方法满足了家禽行业对准确、及时检测的需求，有助于早期监测新出现的血清型（如Heidelberg血清型），并支持主动监测和风险缓解措施。
