印度来源早期颊黏膜口腔癌细胞系TBM-02的建立及其NLRP3炎症小体靶向治疗价值研究

《Human Cell》：Generation and characterization of early stage oral cancer cell line of buccal mucosa of Indian origin

本研究针对印度高发的口腔癌缺乏早期阶段研究模型的瓶颈，成功建立了首例来自印度早期颊黏膜口腔癌（pT2N0）患者的新型细胞系TBM-02。研究人员通过STR分析、核型分析、转录组测序等技术证实该细胞系具有上皮来源（高表达EpCAM、CK8、CK14）、三倍体核型及肿瘤成瘤性，并首次构建了NLRP3炎症小体激活模型。研究发现沉默NLRP3基因可显著抑制TBM-02的增殖、迁移及体内成瘤能力，揭示NLRP3作为口腔癌治疗新靶点的潜力。该模型为早期口腔癌药物筛选及发病机制研究提供了重要平台。

　　

在印度，口腔癌的发病率高居所有癌症之首，尤其是与咀嚼 smokeless tobacco（无烟烟草）习惯密切相关的颊黏膜癌。尽管口腔部位易于检查，但多数患者确诊时已处于晚期，导致五年生存率仅约65%。这种临床困境凸显了对早期口腔癌生物学特性深入研究的迫切性，而开发能够模拟疾病早期阶段的临床前模型是突破诊疗瓶颈的关键。

目前国际上已有的口腔癌细胞系多来源于欧美人群，其遗传背景与印度患者存在差异。更值得注意的是，此前印度本土建立的颊黏膜癌细胞系均来自晚期患者，缺乏代表癌症早期阶段的模型。此外，慢性炎症被认为是癌症的标志之一，其中NLRP3（Nucleotide-binding domain, leucine-rich repeat and pyrin domain-containing protein 3）炎症小体作为胞内多蛋白复合物，在调控免疫稳态和癌症进展中扮演着核心角色。已有研究表明NLRP3在口腔癌组织中高表达，但其在癌症早期发生、发展中的具体作用机制，尤其是在印度人群来源的早期口腔癌模型中，尚不明确。

为了解决上述问题，研究人员在《Human Cell》上发表了他们的最新成果。他们开展了一项旨在建立和鉴定印度来源早期颊黏膜口腔癌细胞系的研究。为了回答这些问题，研究人员从一位34岁、有咀嚼烟草史的早期（pT2N0）颊黏膜口腔癌患者身上获取肿瘤组织，通过外植体培养法成功建立了一个名为TBM-02的新型细胞系，并对其进行了全面的表征和功能研究。研究还重点探讨了NLRP3炎症小体在该细胞系肿瘤发生中的作用。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：从患者肿瘤组织进行原代细胞系建立和长期传代培养；通过短串联重复序列（STR）分析进行细胞系身份认证和交叉污染排查；利用染色体核型分析和流式细胞术进行DNA倍体分析评估基因组稳定性；通过流式细胞术、免疫荧光和透射电镜进行表型和超微结构鉴定；通过体外克隆形成实验、Trans-well迁移实验和裸鼠体内成瘤实验评估其恶性特征；采用RNA测序（RNA-Seq）进行转录组分析，揭示差异表达基因和信号通路；通过药理学抑制剂（MCC950、6-Shogaol）和慢病毒介导的shRNA基因敲降技术靶向NLRP3炎症小体，研究其对肿瘤细胞行为的影响。

分子和形态学表征

研究人员成功将TBM-02细胞系培养至100代，显示出良好的稳定性。该细胞呈现典型的上皮样形态，高表达上皮细胞标志物EpCAM（99.1%），而几乎不表达成纤维细胞标志物α-SMA（0.033%），免疫荧光证实其表达细胞角蛋白CK8和CK14，明确了其上皮来源。

透射电镜揭示了其超微结构特征，如核膜内陷、清晰的线粒体嵴、桥粒等。STR分析证实TBM-02是独一无二的新细胞系，与DSMZ数据库中的任何已知细胞系不匹配，并且检测不到Y染色体。核型分析显示TBM-02为三倍体（69条染色体），并在传代过程中出现染色体数目和结构异常，DNA倍体分析也证实其为非整倍体特性，这些遗传不稳定性是癌细胞的典型特征。

功能表征

TBM-02细胞表现出恶性细胞的特征：其群体倍增时间约为26.39小时；具有强大的克隆形成能力；在Trans-well实验中显示出明显的迁移能力。最重要的是，将TBM-02细胞皮下注射到NOD-SCID小鼠体内后，能够形成肿瘤，并且这些异种移植瘤（CDX）可以连续传代，证明了其体内成瘤性。对形成的肿瘤进行免疫组织化学分析，发现其表达NLRP3、IL-18、Caspase-1等炎症小体通路相关蛋白，提示慢性炎症与肿瘤生长相关。

药物敏感性试验表明，TBM-02对多种标准化疗药物（如紫杉醇、顺铂、吉西他滨等）以及植物化学物6-Shogaol敏感，表明其可作为药物筛选的有效工具。

转录组分析和NLRP3靶向验证

转录组分析显示，与正常颊黏膜组织相比，TBM-02在早期和晚期传代中均有大量基因表达失调。KEGG通路富集分析表明，MAPK信号通路、细胞周期、p53信号通路、PI3K-AKT信号通路等在TBM-02中均发生改变。特别值得注意的是，一些在研究者自身早期口腔癌患者样本中差异表达的基因（如INHBA上调，FAM3B下调）在TBM-02中也呈现相似趋势，而一些晚期肿瘤特征基因（如ACP5, SPP1）在TBM-02中则下调，这支持了TBM-02作为早期癌症模型的特征。同时，TBM-02中TP53、MYC、Ki-67等已知的早期口腔癌相关基因表达上调。

为了验证NLRP3的治疗靶点潜力，研究人员用LPS和Nigericin激活TBM-02细胞的NLRP3炎症小体，发现NLRP3的mRNA和蛋白表达均增加，且蛋白形成多聚体聚集。使用特异性抑制剂MCC950或6-Shogaol处理后，这种激活被显著抑制。随后，他们成功构建了NLRP3稳定敲降的TBM-02细胞系。与野生型细胞相比，NLRP3敲降细胞的增殖（克隆形成能力）、迁移能力均显著降低。更关键的是，在裸鼠体内成瘤实验中，NLRP3敲降细胞的成瘤能力明显减弱和延迟。

研究结论与意义

本研究成功建立并系统表征了首个来源于印度早期颊黏膜口腔癌患者的新型细胞系TBM-02。该细胞系具有明确的印度人群遗传背景、上皮来源特征、遗传不稳定性以及体内外恶性表现，填补了早期口腔癌，特别是印度人群来源的临床前研究模型的空白。

研究的核心发现是证实了NLRP3炎症小体通路在TBM-02驱动的肿瘤发生中起着关键的促进作用。通过基因敲降和药理学抑制两种手段，均证明靶向NLRP3可以有效抑制口腔癌细胞的增殖、迁移和体内成瘤。这不仅为理解慢性炎症在口腔癌，尤其是早期阶段的作用机制提供了直接证据，更重要的是将NLRP3确立为一个有潜力的治疗靶点。

综上所述，TBM-02细胞系及其衍生的NLRP3功能研究模型，作为一个强大且易于获取的平台，具有多重重要意义：首先，它为筛选和评估针对早期口腔癌，特别是印度人群特异性的治疗策略（包括化疗药、靶向NLRP3的药物如MCC950或天然化合物6-Shogaol）提供了宝贵的工具。其次，它有助于深入揭示口腔癌早期发生的分子机制，特别是炎症与癌变的联系。最后，该模型成本相对较低，避免了伦理问题，并能提供不受限制的研究材料，对于在资源有限地区推进口腔癌研究具有重要的实用价值。这项研究为改善印度乃至全球口腔癌的早期诊断、治疗和预后管理开辟了新的途径。