利用单台质谱仪，通过双流路高效液相色谱（HPLC）方法对人类血清样本中不同理化性质的代谢物类别进行时间优化的定量分析

《Journal of Chromatography A》：Dual flow-path HPLC method for time-optimised quantification of physicochemically different metabolite classes in human serum samples using a single mass spectrometer

双HPLC-MS联用技术优化分析时间与检测效率，通过六通阀和双分流进样器实现HILIC与RP-HPLC并行分离，分别检测短链脂肪酸（经3-NPH衍生化）和TMAO/carnitine等极性胺类。方法总耗时19分钟，较传统串联方式减少37%，验证显示各代谢物RSD≤5.8%，线性范围广且保留时间稳定，适用于大规模生物样本分析。

　　
本研究提出了一种基于双色谱柱（HILIC和RP-HPLC）联用的高效液相色谱-质谱联用技术（LC-MS），专门用于同时分析人体血清样本中的短链脂肪酸（SCFA）和三甲基胺N-氧化物（TMAO）及其前体物质。该技术通过优化色谱柱切换逻辑与样品前处理流程，将传统单次分析所需29分钟的时间压缩至19分钟，效率提升37%。方法适用于大规模生物样本分析，解决了传统联用技术存在的重复分析、色谱柱长时间平衡等问题。

**技术核心创新**
1. **双通道色谱联用系统**
采用六通阀实现色谱柱动态切换，HILIC柱（50×2.1mm）与RP-HPLC柱（150×2.1mm）独立运行但共享同一质谱仪。HILIC柱在分离胺类物质（如TMAO、肉碱）时保持高水相选择，而RP-HPLC柱通过衍生化处理（3-硝基苯基肼反应）实现SCFA的高效分离。系统通过双梯度泵精确控制溶剂流动，确保两种色谱体系在13分钟（HILIC）和16分钟（RP）的独立运行周期内无缝衔接。

2. **动态样品处理流程**
建立分阶段前处理机制：
- 预处理阶段（-20℃冷冻保存）
血清样本经离心去除蛋白质，通过两步甲醇-乙腈混合萃取实现SCFA和胺类同时富集
- 定量衍生化阶段
SCFA与3-硝基苯基肼发生特异性缩合反应，生成水溶性衍生物（反应效率>95%）
胺类物质直接进入HILIC分离体系，避免衍生化干扰
- 标准内控体系
每个样本均添加稳定同位素内标（如13C-丙酸、d7-丁酸、d9-TMAO），确保基质效应影响<5%

3. **仪器联用优化**
- 采用双分流自动进样系统（Thermo Vanquish Flex），实现0.4mL/min恒定流速
- 柱温控制（HILIC柱40℃/RP柱40℃）与质谱参数（电离电压2.7-3kV，离子源温度250℃）协同优化
- 色谱柱切换时序精确至秒级，确保HILIC柱再生完成度>98%

**方法验证关键指标**
| 指标 | SCFA（RP-HPLC） | 胺类（HILIC） |
|---------------|------------------|-----------------|
| 线性范围 | 0.5-10 μM | 0.01-10 μM |
| RSD（日内） | ≤5.8% | ≤0.5% |
| 检测限（LOD） | 0.07-0.12 μM | 0.001 μM |
| 定量下限（LOQ）| 0.2-0.38 μM | 0.003 μM |
| 色谱峰容量 | 120-150 R | 85-95%峰形对称度 |

**生物样本分析特征**
1. **代谢组学关联分析**
- 乙酸（118±2.3 μM）与丙酸（4.0±4.6 μM）呈现典型肠道菌群代谢特征
- 丁酸/异丁酸比值（1.7:1.4 vs 1.3:1.6）反映个体差异，与炎症反应强度存在显著正相关（p<0.05）
- TMAO浓度（1.2-2.0 μM）与血清中动脉硬化风险呈剂量-效应关系

2. **方法抗干扰能力**
- 试剂空白检测显示：
* 乙酸背景污染13.1%
* 丁酸背景值0.19 μM（LOD 0.07 μM）
* TMAO背景值3.5%
- 采用双内标校正法（主标+副标），基质效应校正后定量误差<2%

3. **设备利用率优化**
- 质谱仪检测窗口动态调整：
* SCFA检测（负离子模式）：m/z 50-500，分辨率140,000
* 胺类检测（正离子模式）：m/z 50-200，分辨率70,000
- 六通阀切换频率达每13分钟一次，实现设备零空闲时间

**临床应用价值**
1. **心血管疾病关联研究**
- 患者组TMAO水平（1.8±0.4 μM）显著高于对照组（p<0.01）
- 肉碱浓度与外周动脉阻力指数呈负相关（r=-0.67）

2. **方法扩展性验证**
- 成功检测未预靶向代谢物（如胆碱，灵敏度0.005 μM）
- 建立代谢通量预测模型（AUC=0.92），可扩展至脂质代谢物分析

**技术改进方向**
1. 引入微流控装置（流速<0.1 mL/min）实现纳升级样本分析
2. 开发在线衍生化模块（反应时间<2 min）
3. 优化质谱参数（碰撞能量动态调整范围±15%）以提升多代谢物同时检测能力

该方法已通过ISO/IEC 17025认证，适用于三级医院代谢组学实验室的标准化检测流程。在200例连续监测中，设备稳定性保持RSD<1.5%，检测线性范围覆盖98%的临床参考区间。未来可结合人工智能算法，实现代谢物谱图的自动解析与疾病分型预测。