小鼠肠道菌群分析中生物与技术变异性量化及样本量确定的实践指南

《Lab Animal》：Biological and technical variability in mouse microbiota analysis and implications for sample size determination

本刊推荐：为量化实验室小鼠菌群研究中的生物与技术变异性，研究人员通过多层次粪便采样策略，结合16S rRNA扩增子测序，系统评估了笼间、个体及技术重复对α/β多样性指标的影响。结果表明，尽管生物与技术因素贡献显著变异，但其效应量（η2=0.027–0.205）远低于实验变量（η2=0.624）。模拟实验显示重复采样虽可提升统计功效（动物数减少5%），但测序成本急剧增加，提示单样本策略更具实践价值。

　　

在生物医学研究中，肠道菌群（GM）作为定居于胃肠道的高度多样化微生物群落，通过产生代谢物、调节宿主免疫反应等机制，深刻影响宿主的发育、行为及疾病易感性。利用实验室小鼠开展菌群研究，因其可快速、经济地在野生型或疾病模型上应用微生物组实验范式，极大推动了该领域发展。然而，小鼠肠道菌群的组成受到饮食、饲养环境、供应商来源等诸多环境因素影响，导致实验中存在显著的生物与技术变异性。尽管研究者通过控制实验变量、降低饲养密度、标准化样本处理等方式努力减少变异，但个体主体或个体样本固有的变异性如何量化、其对实验结果的影响程度如何，以及能否通过重复采样策略降低动物使用数量，仍是亟待解决的问题。

为回答这些问题，由Zachary McAdams、Kevin Gustafson和Aaron Ericsson共同领导的研究团队在《Lab Animal》上发表了最新成果。他们采用分层粪便采样策略（即对多个小鼠的多个粪便颗粒生成多个测序文库进行测序），系统量化了生物与技术变异的效应大小，并为涉及实验室小鼠的微生物组研究提供了实用指导。

研究团队首先聚焦于两种供应商来源（杰克逊实验室与Inotiv）的小鼠肠道菌群，这些菌群在群落丰富度、多样性及分类组成上存在显著差异，且已知会影响宿主生长、行为及疾病易感性。通过从32只小鼠（每只采集3个粪便颗粒）获得96个粪便DNA样本，并对每个样本制备3个16S rRNA扩增子文库（共288个文库），他们评估了笼、小鼠和技术重复水平上的变异贡献。

主要技术方法包括：1） 使用C57BL/6J小鼠模型，其肠道菌群分别来源于杰克逊实验室（GMLow）和Inotiv（GMHigh）；2） 分层粪便采样设计，涵盖笼、个体小鼠、粪便颗粒及技术重复多个层次；3） 16S rRNA基因V4区扩增子测序（Illumina MiSeq平台）；4） 利用QIIME2进行生物信息学分析；5） 嵌套方差分析（ANOVA）和PERMANOVA评估变异来源效应大小；6） 基于观测到的变异成分进行统计功效模拟和样本量计算。

供应商来源的微生物群在丰富度和多样性上存在差异

研究人员发现，携带杰克逊实验室来源菌群（GMLow）的小鼠其群落丰富度显著低于Inotiv来源菌群（GMHigh）的小鼠（双向方差分析，P_GM< 0.001）。在β多样性方面，供应商是主要的分离因素（主坐标分析第一轴解释68.3%变异）。性别虽也有显著影响，但效应远小于供应商来源。

低丰富度微生物群在基于存在性的α多样性指标中表现出更高的变异性

通过计算变异系数（CV），他们发现GMLow在技术重复和小鼠水平上的丰富度指标（如观察到的丰富度、Chao1指数）CV值显著高于GMHigh（t检验，P < 0.001）。这表明，在低丰富度菌群中，基于存在性的测量更容易受到技术和生物变异的影响，从而降低了精确度。

技术和生物变量相对于实验变量的效应量贡献最小

嵌套模型分析显示，除了技术重复对丰富度指标无显著影响外，技术（文库制备重复）、生物（小鼠、笼）变量均对菌群结果指标贡献了显著变异（P < 0.001）。然而，与实验变量（供应商来源菌群，η2 = 0.624 ± 0.200）的效应量相比，笼（η2 = 0.205 ± 0.118）、小鼠（η2 = 0.126 ± 0.086）和技术重复（η2 = 0.027 ± 0.014）的效应量要低3-20倍。这表明在组间变异较大的实验背景下，生物和技术变异的影响相对较小。

β多样性在样本、主体和笼水平的精确度不同

研究人员进一步评估了群落组成的精确度。技术重复水平的 dissimilarity 最低（Bray-Curtis: 0.056 ± 0.005），表明精确度最高。小鼠内 dissimilarity 增加了近50%（Bray-Curtis: 0.087 ± 0.015），而笼内 dissimilarity 增加了近四倍（Bray-Curtis: 0.192 ± 0.045）。使用未加权的Jaccard距离时，各水平的 dissimilarity 均更高，再次表明基于存在性的测量对变异更敏感。

对个体小鼠的重复采样略微改善效应量但显著增加测序成本

基于观测到的Chao1指数的变异成分（σ²_Mouse= 2710.5, σ²_Sample= 47.1, σ²_Replicate= 121.3），研究团队模拟了在两组实验设计中（例如，检测Chao1指数的差异），增加每只小鼠的粪便样本采集数量对效应量（Cohen's d）和所需最小样本量的影响。模拟设定了高（96）、中（50）、低（25）三种均值差异情景。结果显示，从每只小鼠采集1个样本到采集5个样本，效应量仅边际提升（例如，低差异情景下提升约2.7%），所需每组动物数相应减少（例如，低差异情景下从74只减少到70只，减少约5%）。然而，假设每个样本的测序成本为50美元，检测低均值差异时，对70只小鼠各测5个样本的成本（17,500美元）远高于对74只小鼠各测1个样本的成本（3,700美元）。因此，在当前的测序成本下，对每只小鼠收集并测序一个粪便样本是最实用的策略。

研究结论与意义

本研究量化了微生物组研究中遇到的生物（笼间、个体间）和技术（16S rRNA文库制备）变异性，并首次在具有高组间变异性的实验背景下，系统评估了其相对于实验变量的效应大小。结果表明，尽管这些变量对α和β多样性测量贡献了显著的变异，但其效应量在实验变量效应量较大时相对微小。这提示研究者，在预期实验变量效应量较大的研究中，可以不必过度担忧技术和生物变异的影响。

研究的一个重要发现是，低丰富度菌群（如GMLow）的基于存在性的测量（如丰富度指标、未加权β多样性）具有更高的变异性。这意味着在研究低生物多样性样本（如皮肤、呼吸道样本）时，可能需要考虑对样本进行多次测量以获得更精确的结果。

虽然通过重复采样个体小鼠可以降低个体内变异，从而略微提高统计功效并减少所需动物数量，但随之而来的测序成本急剧增加使得该策略在当前背景下不具实用性。因此，文章建议在涉及小鼠肠道菌群α多样性测量的两组研究设计中，优先采用每只小鼠单次采样的策略，并提供了基于不同α多样性指标和预期均值差异的样本量计算指导。

该研究为微生物组实验设计提供了切实可行的依据。它强调了在实验变量效应量可能较小的研究设计中，需要考虑生物和技术变异的影响，并探讨了通过减少笼饲养密度或有意 homogenization（如共享污染垫料）等策略来减轻笼效应的潜力。最终，这项工作在遵循3R原则（替代、减少、优化）尤其是“减少”原则方面做出了贡献，为在微生物组研究中更伦理、更高效地使用动物模型提供了科学支撑。