基于VHH抗体环设计的大环肽可强效抑制流感病毒膜融合

《npj Viruses》：VHH antibody loop guides design of a synthetic macrocyclic peptide that potently blocks influenza virus membrane fusion

本刊推荐：为解决流感病毒血凝素(HA)难以靶向的问题，研究人员以单域抗体(sdAb)CDR3环为模板设计大环肽。所得肽CP1可纳摩尔级结合HA，通过稳定融合前构象广谱中和甲型流感病毒，为研发新型抗病毒药物提供了新策略。

　　

流感病毒因其抗原漂移和抗原转换能力，导致季节性流感和潜在的大流行威胁持续存在。病毒表面的血凝素(HA)蛋白，是介导病毒入侵宿主细胞的关键蛋白，成为抗病毒药物研发的重要靶点。然而，HA的茎部区域虽然在不同毒株间相对保守，但其结合表面平坦且复杂，传统小分子药物难以高效靶向。而单克隆抗体等生物制剂虽具有高亲和力和特异性，但存在细胞渗透性差、生产成本高昂等局限性。因此，开发能够兼顾小分子和抗体优势的新型治疗模式，是抗病毒领域亟待突破的难题。

在这项发表于《npj Viruses》的研究中，Rameshwar U. Kadam、Jarek Juraszek、Ian A. Wilson等研究人员及其合作团队，另辟蹊径地从骆驼科动物（如羊驼）体内天然存在的单域抗体(sdAb，也称为纳米抗体VHH)中寻找灵感。这些单域抗体的互补决定区3(CDR3)环通常更长，且在与抗原结合中贡献了大部分相互作用，其本身结构相对稳定。研究团队设想，能否将这种关键的结合环“迷你化”，设计成结构稳定、功能强大的合成大环肽，从而模拟单域抗体的结合能力和中和活性？

为了验证这一设想，研究人员发展了一种名为“单域抗体互补位模拟设计”(sdAb paratope mimetic design, PMD)的策略。该研究以之前报道的能够广谱中和甲型流感病毒Group 1的血凝素的单域抗体sdAb38为起点。通过分析sdAb38与HA的复合物晶体结构，他们确定了其17个氨基酸的CDR3环是结合HA茎部区域的主要功能域。随后，研究人员以这个CDR3环为核心序列，尝试了多种策略来稳定其构象：首先合成了线性肽LP1；进而，为了约束肽链的构象，使其更接近在抗体中的天然活性构象，他们设计并合成了一个包含14个成员的大环肽库(CP1-CP14)。这些肽通过不同的方式成环：有的使用脯氨酸-脯氨酸(Pro_D-Pro_L)或脯氨酸-甘氨酸(Pro_D-Gly)等易于形成β-转角的三肽模板；有的通过半胱氨酸-半胱氨酸(Cys-Cys)形成二硫键进行环化；还有的尝试了直接的头尾环化。在设计中，他们将CDR3环中的一个精氨酸(Arg)残基替换为谷氨酸(Glu)，旨在改善与HA上天冬酰胺46(Asn46)的形状互补性并提高肽的溶解性。

为开展研究，团队主要应用了以下几项关键技术：基于Fmoc化学的固相肽合成与环化技术、表面等离子共振(SPR)技术分析结合动力学、AlphaLISA竞争结合实验、基于细胞（Calu-3）的病毒中和试验(VNA)、X射线蛋白质晶体学解析肽-HA复合物结构、构象变化抑制(CCI)试验和胰蛋白酶敏感性(TS)试验评估融合抑制机制，以及体外细胞渗透性评估。

结果

sdAbs作为肽模式设计的模板

研究人员比较分析了多种抗体和单域抗体的HCDR3环，发现单域抗体的CDR3环平均比人和小鼠常规抗体的HCDR3环更长，且在与靶标抗原的相互作用中贡献了约67%的重原子接触，这表明其作为肽模拟物设计模板的独特优势。

体外结合、动力学和病毒中和

活性筛选结果显示，线性肽LP1的结合亲和力较弱（K_D在微摩尔级别），且解离很快。而成环显著改善了肽的性能。在众多环肽中，基于D-脯氨酸-L-脯氨酸(Pro_D-Pro_L)模板的19肽CP1表现最为突出。它对甲型流感病毒Group 1的H1/Cal HA的结合亲和力(K_D)达到了50 nM，比线性肽LP1提高了约60倍。在AlphaLISA竞争实验和病毒中和实验(VNA)中，CP1也显示出纳摩尔到亚微摩尔级别的强效抑制活性（IC₅₀0.052–0.84 μM，对H1N1病毒的EC₅₀为0.13 μM）。结合动力学分析表明，CP1与HA形成的复合物非常稳定，其解离半衰期(t_1/2)长达5-46秒，远优于线性肽（0.2-0.5秒）。这种较长的驻留时间被认为是其中和活性的关键。其他模板（如Pro_{D-Gly）或更短环长的肽，其结合和中和活性均有所下降。含有二硫键的环肽CP8（15肽）也表现出不错的结合和中和活性，但优于CP1。这些数据表明，合适的环化模板和环的长度对于保持甚至增强基于CDR3环的肽的功能至关重要。}

互补位模拟肽与HA结合的结构基础

为了在原子水平理解肽的作用机制，研究人员解析了关键肽（CP1, CP8以及无模板的环肽CP14）与H1/PR8 HA的复合物晶体结构，分辨率在1.59-2.87 ?之间。结构显示，所有这些肽都结合在HA1和HA2亚基界面处的同一个保守疏水沟槽中，完美地模拟了母本单域抗体sdAb38的CDR3环的结合模式。肽CP1的结合使得HA1和HA2上分别有约148 ?2和440 ?2的表面积被埋藏，与sdAb38的效果相当。详细的相互作用分析揭示，CP1通过其上的酪氨酸97(Tyr97)、天冬氨酸99(Asp99)、亮氨酸100A(Leu100A)等多个残基与HA上的关键区域形成广泛的疏水作用和氢键网络（包括与HA2螺旋A上的谷氨酰胺42(Gln42)和苏氨酸49(Thr49)的相互作用），并直接或通过水分子与HA2上的天冬氨酸19(Asp19)等残基作用。特别重要的是，肽CP1的天冬氨酸99(Asp99)在环内与甘氨酸100B(Gly100B)和缬氨酸100C(Val100C)的骨架形成氢键，这有助于稳定肽的活性构象。这种结合模式如同“分子胶水”，将HA1和HA2亚基紧密地“粘合”在一起，从而稳定了HA的融合前构象，阻止其向融合后构象转变。

HA结合特异性和融合抑制机制

结合特异性实验表明，CP1能特异性结合甲型流感病毒Group 1（如H1, H2, H5, H6, H9, H11等亚型）的HA，但不结合Group 2或乙型流感病毒的HA。这种特异性与结合位点的细微差异有关，例如Group 2 H3 HA在HA1 38位点有一个糖基化位点，以及HA2螺旋A上关键残基的差异。在机制研究中，胰蛋白酶敏感性试验和构象变化抑制试验均证实，CP1能够有效抑制低pH诱导的HA构象变化，使其无法转变为易被胰蛋白酶消化的融合后形式，其作用机制与已知的茎部靶向广谱中和抗体（如CR9114）相似。数据分析还发现，肽的中和活性(EC₅₀)与其在SPR中测得的驻留时间(t_1/2)具有良好的相关性，表明约15秒的驻留时间是实现有效病毒中和的阈值。此外，初步的细胞毒性试验表明这些设计的肽在高达100 μM浓度下对Calu-3细胞无毒性。对CP1和CP14的初步渗透性评估显示它们具有较低但可检测的膜渗透性，且不是P-糖蛋白(P-gp)的底物，这为后续优化以提高口服生物利用度提供了可能。

讨论与结论

本研究成功展示了一种创新的、基于结构的肽设计策略——单域抗体互补位模拟设计(PMD)。该策略巧妙地利用了单域抗体长CDR3环的结构稳定性和高配体效率，将其作为设计功能性大环肽的蓝图。研究人员成功地将一个具有广谱中和活性的单域抗体sdAb38的关键结合环，转化为一个具有纳摩尔级别亲和力、能够有效中和甲型流感病毒Group 1的19氨基酸大环肽CP1。通过详细的生物物理、生物化学和结构生物学表征，研究证实CP1精确地模拟了母本抗体的结合模式和功能机制，即通过稳定HA的融合前构象来阻断病毒膜融合过程。

这项研究的重要意义在于，它为解决靶向传统上“不可成药”的蛋白-蛋白相互作用界面（如流感HA茎部）提供了一条新路径。所开发的大环肽CP1结合了小分子（潜在的可渗透性、合成相对简便）和抗体（高亲和力、高特异性）的一些优点，展现出良好的开发成为广谱抗流感病毒药物的前景。尽管当前CP1对Group 2病毒无效，且其口服生物利用度等成药性参数仍需进一步优化，但本研究确立的设计原则和获得的先导化合物，为基于抗体的肽模拟物设计领域注入了新的活力，不仅对流感治疗，也对针对其他具有挑战性靶点的药物研发具有重要的启发意义。