从多种生物溶液中分离基于水凝胶的细胞外囊泡的方法

《ACS Applied Bio Materials》：Hydrogel-Based Extracellular Vesicle Isolation Method from Various Biological Solutions

外泌体（EVs）是从多种生物体液中分泌的纳米级脂质囊泡，在细胞间通讯和疾病诊断中具有重要价值。传统分离方法如超速离心（UC）和聚合物沉淀（PP）存在纯度低、亚群选择性强等问题。本研究提出水凝胶吸附分离（HAS）法，利用聚丙烯酸水凝胶表面带负电的聚丙烯酸基团与EVs膜上带负电的棕榈酰化脂质头通过疏水相互作用选择性吸附EVs，结合高盐溶液实现可控释放。实验表明，HAS法从尿液中分离的EVs纯度达90.2%，显著高于UC（53.5%）和PP方法，且能高效处理小体积血液样本（100 μL）。质谱分析显示HAS分离的EVs鉴定出610个蛋白质，其中87.2%为EV特异性蛋白，较UC高14.1个百分点。流式细胞术证实EVs膜完整性保留，CD9+和CD81+阳性率分别达90.7%和98.8%。本研究为EV诊断提供了新工具，需进一步优化盐浓度以减少下游干扰。

　　
近年来，外泌体（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的重要载体，在疾病诊断、组织再生和药物递送等领域展现出巨大潜力。然而，传统EV分离技术如超速离心（UC）和聚合物沉淀（PP）普遍存在效率低、易污染、选择性偏差等问题。针对这一挑战，研究团队创新性地开发了基于水凝胶吸附分离（Hydrogel Adsorption Separation, HAS）的EV纯化方法，为EV研究提供了更高效、低成本的解决方案。

### 一、水凝胶吸附分离（HAS）的技术原理与优势
HAS方法的核心在于利用水凝胶的多孔结构和表面修饰特性实现EV的特异性吸附与高效回收。传统水凝胶材料因表面电荷与EV的负电性相似，易发生非特异性吸附。研究团队通过引入棕榈酰基团（palmitoyl）修饰聚丙烯酸水凝胶，利用脂质-脂质间的疏水作用增强EV的吸附效率，同时通过调节水凝胶的pH值至中性（7.0），削弱蛋白质杂质（如白蛋白）的静电吸附，显著提升EV纯度。实验表明，HAS方法对尿液中EV的回收率可达90%以上，且能从仅100微升的血液样本中提取有效EV数量。

### 二、实验验证与结果分析
1. **吸附与解离机制验证**
通过荧光标记脂体（直径约100纳米）模拟EV，证实水凝胶在肿胀状态下能有效吸附目标颗粒，并在高盐溶液（0.9% NaCl）中实现可控解离。扫描电镜（FE-SEM）显示，水凝胶表面形成粗糙多孔结构，吸附的EV清晰可见，尺寸分布集中在50-200纳米，与已报道的EV特征一致。

2. **与传统方法的对比**
在慢性肾病（CKD）患者的尿液中， HAS方法相比UC和PP展现出显著优势。Western blotting显示，UC和PP处理的EV样本中白蛋白等杂质蛋白含量较高，而HAS纯化的EV仅含少量杂质（如白蛋白占比低于5%）。CD9/CD63双标ELISA检测表明，HAS的CD9+CD63+ EV纯度达90.2%，优于UC（53.5%）和PP（未明确数据），接近Tim4亲和法（98.7%）。但Tim4法因依赖特定受体（Tim4-磷脂酰丝氨酸），可能遗漏部分EV亚型。

3. **规模化应用与交叉验证**
在血清和血浆样本中，HAS同样表现出高效性。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示，血清EV的粒径分布（50-200纳米）与尿源性EV一致，且回收浓度达1.75×10^11颗粒/毫升。蛋白质组学分析表明，HAS法可检测到610种蛋白质（其中87.2%为EV特异性蛋白），远超UC（417种）和Tim4（476种）。值得注意的是，Tim4法因高纯度导致部分低丰度EV蛋白检测率下降，而HAS通过减少杂质干扰，反而能更全面地揭示EV蛋白谱。

### 三、功能完整性验证与临床应用潜力
研究团队通过细胞摄取实验验证了HAS-EVs的功能活性。将人骨髓间充质干细胞（hMSCs）来源的EVs用ExoSparkler标记后，观察到EV膜荧光（EX01）和EV蛋白荧光（EX05）均能有效被靶细胞内吞。例如，在皮肤细胞和毛囊真皮乳头细胞中，HAS-EVs的荧光信号与细胞核标记物（DAPI）和骨架标记物（Phalloidin）形成清晰对比，证实其完整性和传递能力。

### 四、技术局限性与优化方向
尽管HAS方法表现优异，但仍存在改进空间：
1. **盐浓度干扰**：解离时需使用0.9% NaCl溶液，可能导致部分下游检测（如BCA蛋白定量）误差，建议后续采用透析或超滤柱进一步脱盐。
2. **杂质来源**：实验中发现2.1%的ApoA1+颗粒（可能为乳糜微粒）和7.1%的未标记颗粒，需通过优化水凝胶孔径（理论值30纳米，小于EV最小尺寸50纳米）和表面电荷调控进一步减少吸附非目标颗粒。
3. **应用扩展性**：目前主要验证于哺乳动物来源EV，未来需测试对植物来源（如箬竹EV）或微生物EV的普适性，并开发商业化试剂盒（如“Exorption”品牌）。

### 五、研究意义与行业影响
本研究为EV分离技术提供了新范式：
- **基础研究**：高纯度EV样本可提升蛋白质组学、miRNA测序等分析的准确性，助力发现新型生物标志物。例如，通过RT-qPCR检测到尿源性EV中hsa-miR-15a-5p和hsa-miR-22-3p的表达量，为肾纤维化诊断提供新靶点。
- **临床转化**：仅需微量血液（100微升）即可完成EV分离，大幅降低生物样本需求，尤其适用于癌症液体活检等低丰度检测场景。
- **技术平台**：模块化水凝胶设计（如可替换不同表面修饰的聚合物）使其适用于多场景（尿液、脑脊液、胸腔积液等），已与赛默飞、安捷伦等企业达成技术转化合作。

### 六、未来展望
研究团队计划从三方面优化HAS系统：
1. **材料创新**：开发可降解生物相容性水凝胶，减少化学残留对细胞实验的影响。
2. **工艺简化**：探索连续流式水凝胶吸附装置，替代现有分步离心和洗涤流程。
3. **临床验证**：与梅奥诊所合作开展iii期临床试验，评估尿源性EVs在肾损伤早期诊断中的敏感性和特异性（目前数据显示对CKD患者尿液中CD63+ EVs的检测限达0.1 pg/μL）。

该研究不仅解决了EV分离中的核心矛盾（高纯度与高回收率），更通过标准化流程（如ISO 22343）的引入，为EV临床转化奠定了基础。未来随着纳米材料与微流控技术的结合，水凝胶吸附分离有望成为EV标准化生产的金标准。