综述：追踪炭疽芽孢杆菌：MALDI-TOF生物标志物在科学文献中的研究传承

《ACS Omega》：Tracking Bacillus anthracis: The Legacy of MALDI-TOF Biomarkers in Scientific Literature, a Review

　　

炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）是一种革兰阳性、产芽孢细菌，为炭疽的病原学病因。炭疽是一种再发性、败血症性、出血性且常致死的疾病，可感染人类及家养与野生反刍动物。鉴于其高致死率、芽孢稳定性及易传播特性，该病原体被认定为重要生物战剂，并被列为A类生物恐怖威胁因子。快速且明确的鉴定至关重要，但受限于炭疽芽孢杆菌与近缘种（尤其是蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus））的高度相似性，这一目标面临挑战。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）凭借成本效益、速度及微生物鉴定的可靠性，已成为诊断实验室日益普及的工具。本综述通过系统文献分析，汇总已报道的炭疽芽孢杆菌生物标志物，并评估各研究中采用的方法学。研究人员共识别出文献中报道的87种炭疽芽孢杆菌生物标志物，并根据其与苏云金芽孢杆菌群（Bacillus cereus group）其他成员的特异性进行分类。此外，本研究强调了方法学标准化与生物标志物验证方面的空白，指出亟需开发稳健方案以确保生物防御及监测背景下炭疽芽孢杆菌的精准检测。基于此，研究人员提出一套标准化分析工作流程，旨在提升诊断可靠性，并推荐了增强质谱技术在炭疽芽孢杆菌特异性鉴定中应用的工具与最佳实践。

1. 1.
   引言
   基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）实现了微生物分析与鉴定的快速化与高可靠性，其优势在于通用型样品制备平台可适用于细菌、真菌及酵母等广泛类群，同时降低了运营成本。作为诊断工具，MALDI-TOF MS可从遗传与蛋白质组学层面区分微生物物种，但近缘种的鉴别仍是重大挑战。炭疽芽孢杆菌属于广义芽孢杆菌属下的革兰阳性、杆状、产芽孢细菌，可引起炭疽——一种全球分布的动物地方性与人畜共患疾病，呈败血症性、出血性且常致死，主要影响亚洲、非洲大部分国家及欧洲、美洲部分地区的野生与家养草食动物。该物种毒力强，其芽孢在不利环境条件下极具耐受性，可在土壤中存活数年。值得注意的是，炭疽芽孢杆菌芽孢曾被用作粉末制剂中的生物武器，如2001年美国发生的生物恐怖相关信件袭击事件所示。
   这种双重属性使得针对临床、流行病学及生物安全目的的快速精准鉴定方法成为必需。传统微生物学与分子学方法受限于炭疽芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌群其他成员在表型与遗传学上的高度相似性。尽管MALDI-TOF MS在速度、成本及诊断可靠性方面具有优势，但其应用于高风险病原体时仍需严格的方法学标准化与稳健验证。鉴于炭疽芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌间遗传及蛋白质组学高度相似，且针对生物恐怖主义相关微生物的MALDI-TOF MS谱库多样性有限，本综述通过系统分析现有方法学，提出标准化分析方案，并明确炭疽芽孢杆菌特异性生物标志物，以支持诊断与生物防御场景下的精准检测。
2. 2.
   生物战特性与鉴定挑战
   2.1. 炭疽芽孢杆菌作为生物威胁
   生物恐怖主义是恐怖分子以恐吓平民与当局、推进其政治、宗教或意识形态目标为目的，将生物制剂用作武器的一种形式。炭疽芽孢杆菌具备多项适合生物战应用的特性：吸入暴露后致死率高（未治疗时死亡率>80%）、易生产与扩散、因产芽孢能力而具有显著的环境稳定性，以及适于深部呼吸道沉积的理想粒径（1–5 μm）。单次暴露事件即可造成污染，且因疾病潜伏期差异，病例可能在不同地点、不同时间被发现。疾病进展也可能因个体健康状况、既往免疫力等因素存在差异，因此难以区分蓄意生物攻击与自然感染性疾病的暴发，尤其在未公开事件中。2001年美国炭疽袭击事件凸显了生物恐怖主义的深远社会经济影响，共造成22例确诊病例（11例吸入性、11例皮肤性），5例死亡，超过30000人接受预防性治疗，直接经济损失超60亿美元，同时也暴露了快速诊断能力的严重不足，强化了早期检测与鉴定方法改进的迫切需求。

2.2. 鉴定挑战

炭疽芽孢杆菌属于厚壁菌门、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，是苏云金芽孢杆菌群（亦称大芽孢杆菌群或蜡样芽孢杆菌 sensu lato群）的成员。该属微生物分布广泛，可从土壤、海水、淡水及各类食品中分离得到。这类细菌产生的芽孢是具有多层结构的休眠体，可存活数十年，理想条件下甚至可达数百万年。该群的主要致病特征归因于通常由质粒编码的毒素。炭疽芽孢杆菌携带两个对其毒力至关重要的质粒：pXO1（182 kb），编码毒素合成；pXO2（96 kb），编码聚-γ-D-谷氨酸荚膜。这两种质粒在特定条件下可转移至近缘种，尤其是大芽孢杆菌群内物种。炭疽芽孢杆菌菌株中存在无荚膜变异株（pXO1⁺/pXO2^–），已在环境样本中检出，有时与强毒株共存。两个质粒的同时存在被认为是鉴定致病性炭疽芽孢杆菌的关键，任一质粒丢失会导致毒力减弱，两者均丢失则完全丧失毒力。

炭疽芽孢杆菌呈全球分布，区域可分为高地方性、地方性与散发性。全球估计每年发生2000至20000例人间病例，但世界卫生组织指出实际发病率可能高出10倍，因许多国家未强制报告，部分国家缺乏官方数据或不完整。苏云金芽孢杆菌群内可发生质粒转移（或部分质粒转移），产生“类炭疽”蜡样芽孢杆菌菌株，携带与炭疽芽孢杆菌高度相似的质粒，并能引起炭疽样疾病。其中重要的是蜡样芽孢杆菌生物变种炭疽（Bcbva），其含有pXO1和pXO2，在动物中引起的疾病在临床上与经典炭疽无法区分。自2004年起，陆续报道了引起人与其他哺乳动物吸入性炭疽样疾病的非典型蜡样芽孢杆菌菌株，这些菌株携带pXO1样质粒（pBCXO1），其核苷酸序列与炭疽芽孢杆菌pXO1质粒同源性约99.6%。在喀麦隆与科特迪瓦，Bcbva菌株已在黑猩猩、大猩猩、猴子、大象及多种家畜中检出，引发西非大规模炭疽样疫情。鉴于其与炭疽芽孢杆菌的高度相似性，美国卫生与公众服务部已将Bcbva列入潜在生物恐怖用途的选择性病原体清单。

炭疽芽孢杆菌鉴定的困难主要源于其与蜡样芽孢杆菌及其他近缘种在表型与遗传学上的高度相似性。环境样本中炭疽芽孢杆菌通常以芽孢形式存在，而临床标本中为营养细胞，因此检测策略需根据样本类型调整。炭疽芽孢杆菌的鉴定通常基于形态特征、生化试验（如运动性、溶血性、卵磷脂酶活性）、γ噬菌体敏感性、青霉素敏感性及靶向染色体与质粒基因的PCR等分子方法。尽管这些方法具有一定效用，但仍存在局限性：周转时间较长，明确诊断通常需18–48小时；表型变异增加了诊断难度，部分菌株表现出非典型特征；技术复杂度高，需专业经验及高级别生物安全设施；成本高昂，依赖昂贵试剂与设备；可靠性存疑，菌株间变异可能导致假阳性或假阴性结果。这些限制凸显了对成本效益高、高通量且可靠的诊断方法的迫切需求，尤其强调对人与动物炭疽芽孢杆菌的早期检测。其他基于质谱的方法，如气相色谱-质谱（GC–MS）与基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）也有应用，但多项研究指出，MALDI-MS虽可区分炭疽芽孢杆菌，但蜡样芽孢杆菌与炭疽芽孢杆菌的谱指纹高度相似，构成重大障碍。

1. 3.
   MALDI-TOF MS生物标志物分析
   该技术主要包括电离、分析与检测三个阶段。首先将微生物样品与称为基质的有机化合物混合，并在金属板上共结晶。随后脉冲激光束照射晶体，基质吸收激光能量并将其传递给分析物分子（主要为蛋白质），促进其从板面解吸并通过质子化（[M + H]⁺）实现电离。所得离子经电场加速进入真空管（飞行时间（TOF）分析器）飞向检测器。离子飞越该距离的时间被高精度测量：低质量离子更快到达检测器，高质量离子则需更长时间。通过这些测量可计算各离子的质荷比（m/z）。对于微生物，MALDI-TOF MS通常用于生成主要由核糖体蛋白及其他保守、丰度高的细胞蛋白组成的蛋白质组指纹图谱。所得质谱与包含已表征生物谱图的参考数据库比对，若样品谱图与参考条目高度一致，则可实现快速准确的种水平鉴定，部分情况下可达亚种水平。针对炭疽芽孢杆菌，该技术已广泛应用于细菌蛋白质组的全面表征，包括具有不同质粒组成的营养细胞、成熟芽孢及萌发芽孢。
   MALDI-TOF MS可检测的生物标志物不仅来源于蛋白质，还可来自脂质与小有机分子等其他生化类别。这些分子蕴含丰富的分类学信息，使得发现独特生物标志物成为可能，为检测广谱生物制剂提供了前景。另一潜在生物标志物是吡啶二羧酸（DPA），其在细菌芽孢中与钙结合后浓度极高，但并非炭疽芽孢杆菌特有。因此，质谱是发现与鉴定蛋白质标志物的强大工具。针对炭疽芽孢杆菌，该方法已广泛用于蛋白质组表征，尤其是不同质粒组成的营养细胞。
2. 4.
   结果与讨论
   4.1. 生物标志物分析
   1996年至2025年间发表的16项研究共报道了87种与炭疽芽孢杆菌鉴定相关的生物标志物，涵盖核糖体蛋白、小分子酸溶性蛋白（SASPs）及其他细胞组分等多类分子，质荷比（m/z）范围为2385至7744。1996年，Krishnamurthy团队首次将MALDI-TOF MS应用于炭疽芽孢杆菌鉴定，通过辐照灭活病原体，描述了津巴布韦株炭疽芽孢杆菌谱图中m/z 6679、6835及7082处的质谱峰。1999年，Hathout团队在斯特恩株（Sterne）芽孢中证实了m/z 6679与6835处的峰。2000年，Ryzhov、Hathout与Fenselau仅将m/z 6678确定为炭疽芽孢杆菌特有。
   2001年，Elhanany团队研究了炭疽芽孢杆菌芽孢及苏云金芽孢杆菌群其他成员（蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌）及更远缘芽孢杆菌属物种（如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）的生物标志物，但4–10 kDa范围内检出的假定生物标志物在正线性模式下质量准确度仅中等。2003年，Hathout团队重新分析了m/z 6679、6835与7082处的峰，证实其分别对应小分子酸溶性蛋白（SASPs）——β-SASP、α-SASP与α/β-SASP，提示其作为芽孢物种水平生物标志物的潜力。Stump团队（2005）随后确认m/z 6679为炭疽芽孢杆菌生物标志物。Castanha团队（2006）联合使用MALDI-TOF MS、电喷雾电离离子阱MS与MS/MS，在所有受试的炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌菌株中鉴定出两种SASP峰：β-SASP峰质量与序列存在变异，在炭疽芽孢杆菌中为6679 m/z，在蜡样芽孢杆菌/苏云金芽孢杆菌中为6695/6711 m/z；而α-SASP在所有菌株中均稳定出现在6835 m/z处。
   2008年，Callahan团队确定m/z 6675为炭疽芽孢杆菌Delta株特有。2009年，Lasch团队鉴定出苏云金芽孢杆菌群的m/z 5171、5886与7368处生物标志物，而炭疽芽孢杆菌在m/z 4606、5413与6679处表现出特异性峰。然而，这些信号均无完全判别力：曾被认为物种特异性的β-SASP信号（6679 m/z）也在部分蜡样芽孢杆菌谱图中检出。同样，Dybwad团队（2013）在蜡样芽孢杆菌DSM 8438、蜡样芽孢杆菌R3及苏云金芽孢杆菌BGSC 4CC1中发现了6679 m/z峰。此前认为炭疽芽孢杆菌芽孢特有的5413 m/z峰，在无芽孢时也可检出，削弱了其特异性。
   2013年，Jeong团队在芽孢相关30个峰中鉴定出多个炭疽芽孢杆菌芽孢特异性生物标志物（m/z 2503、3089、3376、6684、6698、6753与6840）。Pauker团队（2018）报道了m/z 2445与4440处的生物标志物，但未检出Lasch（2009）、Dybwad（2013）或Castanha（2006）此前描述的峰。2021年，Manzulli团队通过MALDI-TOF MS鉴定出苏云金芽孢杆菌（2956、2968与3411 Da）、蕈状芽孢杆菌（5422 Da）、炭疽芽孢杆菌（3339、3592、4871与9740 Da）、魏氏芽孢杆菌（4637、7324与9272 Da）及威亨斯芽孢杆菌（5443 Da）的物种特异性信号。2020年，Wei团队报道m/z 3682.4、5476.7、6610.6、6680.1、7792.4、9475.8与10934.1可作为区分炭疽芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌的标志物。
   2025年阿根廷Rocca团队的研究确定了9种炭疽芽孢杆菌特异性生物标志物：5413 Da、6675–6679 Da、2994 Da（经主成分分析（PCA）确认为主要生物标志物）、4333、5886、7163、9211、15100与16000 Da。尽管6675与6679 Da峰此前已在蜡样芽孢杆菌中报道，但2994 Da生物标志物对炭疽芽孢杆菌表现出强统计判别力。
   尽管取得上述进展，区分炭疽芽孢杆菌与其近缘种（蜡样芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌）仍具挑战性。因此，寻找真正物种特异性生物标志物的工作仍需继续。关于蜡样芽孢杆菌生物变种炭疽（Bcbva）的MALDI-TOF MS鉴定数据仍十分匮乏。2014年，曾被认为炭疽芽孢杆菌特有的β-SASP标志物在Bcbva的CI与CA菌株及蜡样芽孢杆菌B06020中通过LC-MS/MS检出。Dupke团队（2018）鉴定出一种迄今仅在Bcbva菌株中发现的蛋白——pXO2–60（35 kDa），并通过MALDI-TOF MS在蛋白提取后确认了其预测切割位点与N端序列，进一步体现了生物标志物鉴定方法学标准化的缺失。2014年，Chenau等强调，针对炭疽芽孢杆菌芽孢（环境持久性的主要形式及免疫检测试验的核心靶标）尚未鉴定出相关标志物。
   后续研究表明，除报道的生物标志物总数外，其在菌株多样性、形态状态及实验条件下的精准度才是关键因素。Pauker团队（2018）与Manzulli团队（2021）分析了广泛的苏云金芽孢杆菌群菌株，发现MALDI-TOF MS生成的营养细胞谱图包含可区分炭疽芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌及其他苏云金芽孢杆菌群物种的峰子集。然而，多个最初被认为独有的峰（尤其是6.6–6.8 kDa范围内的峰）在扩大菌株集检验时被证实为共有。2023年，Abdelli团队证明，炭疽芽孢杆菌样菌株中这些峰子集的联合存在与炭疽分支的基因组亲缘性更高相关。因此，文献报道的MALDI-TOF MS指纹图谱不仅能区分物种，还揭示了炭疽样菌株向炭疽芽孢杆菌的蛋白质组与基因组聚类特征，这对公共卫生监测及具有炭疽样致病潜力的新兴谱系早期检测具有重要意义。采用互补方法（包括高级统计分析及扩展菌株面板交叉验证）的研究结果一致表明，诊断可靠性关键取决于明确定义的质谱峰组合。在此背景下，鸟枪法LC-MS/MS等技术已被用于鉴定炭疽芽孢杆菌物种特异性肽段，以补充和验证MALDI-TOF定义的生物标志物。2022年，Witt团队证明某些源自核蛋白与表面蛋白的肽段在炭疽芽孢杆菌菌株中保守，且在近缘苏云金芽孢杆菌群物种中缺失，并提出了一套肽段标志物组合。Bothra团队（2023）则利用LC-MS研究了毒素产生（PA、LF、EF）的环境调控机制，将毒素相关生物标志物与细菌生理状态关联，这对动物模型或真实暴露场景的结果解读具有重要参考价值。
   尽管近三十年来已鉴定出大量生物标志物，但许多与近缘种（尤其是蜡样芽孢杆菌）存在交叉反应，损害了其在生物监测与生物防御应用中的特异性。近期研究指出，炭疽芽孢杆菌潜在的初级判别指标为m/z：2603、2994、3203、3339、3353、3396、3450、3590、4063、4248、4313、4505、4606、4871、5413、5476、6610.6、6684、6753、6840、7365、7744。

4.2. 方法学分析

研究间的方法学多样性是导致重现性差及炭疽芽孢杆菌参考生物标志物缺乏共识的主要原因。各研究采用不同的分析检测方案及数据分析/解读流程，导致结果模棱两可，无法进行跨研究结果的直接比较。1996至2025年的出版物显示，方法学在10个类别上存在差异：培养基（15种不同配方）、激光 shots（9个不同范围，50–2000次）、设备（8种不同型号）、校准品（7种不同类型）、MALDI基质（3种不同类型）、操作模式（6种不同模式）、化学/酶提取（6种不同方法）、灭活方法（4种不同类型）、细胞破碎方法（4种不同技术）、激光类型（2种不同类型）。

这凸显了聚焦于识别、验证并将真正物种特异性生物标志物纳入参考数据库，以及实施明确优先考虑特异性的分析算法的必要性，以确保MALDI-TOF MS鉴定炭疽芽孢杆菌的准确性与可靠性。尽管如此，文献中反复强调MALDI-TOF MS用于炭疽芽孢杆菌鉴别的若干局限性：现有参考库不足，未能充分代表流行菌株的遗传与表型多样性，尤其是与生物恐怖防范及非典型环境分离株相关的菌株；方法学缺乏协调，导致实验室间结果可变且不可重现；验证不充分，大量拟议生物标志物的特异性未在广泛多样的菌株面板上进行系统评估；质量保证存在缺陷，缺乏能力验证计划与标准化性能指标。2025年，Lasch团队开发了高性能生物安全（HPB）谱库，包含来自BSL-3/4病原体（含炭疽芽孢杆菌）的数千张MALDI-TOF MS谱图。该系统将物种特异性保守“核心”峰直接嵌入主谱图（MSPs）中，从而提升了实验室间重现性。与此同时，Florencia团队（2025）等研究探索了机器学习方法在MALDI-TOF MS衍生谱图中的应用，用于炭疽诊断与监测，能够从监督模型中提取完整光谱指纹作为多维特征向量，而非依赖人工检查有限的m/z值集合。

当实验室因方法学不标准而产生不同的生物标志物谱图时，与共享参考库的对比本身即面临挑战。因此，需在四个核心领域进行方法学标准化以克服这些局限并增强诊断稳健性。基于现有分析，研究人员提出了一套协调方案，涵盖以下领域：样品制备标准（标准化生长条件、统一细胞裂解程序、使用等量样品）；分析参数（基质组成、分析质量范围、仪器设置与校准方案）；数据处理标准（峰检测阈值、质量容差参数、最低谱图质量要求、明确优先考虑特异性的匹配算法与评分系统）；质量控制要求（每日性能检查、校准验证、阴性对照与无菌培养基使用、定期参与能力验证计划）。具体建议方案包括：样品采集（临床或环境样本采集）；培养与孵育（接种于AK NR2琼脂或TSA平板，37°C孵育18–24小时）；灭活（70%三氟乙酸（TFA）处理或经验证的加热法确保灭活）；细胞裂解（1 μL样品悬液与1 μL基质（HCCA + SA）混合，移液或涡旋混匀）；点样与干燥（混合物点样于MALDI靶板，室温风干）；仪器设置（HCCA 10 mg/mL溶于50%乙腈/0.1% TFA；线性模式，20 kV，每日校准）；谱图采集（每份样品采集≥10张合格谱图；以基质与无菌培养基为阴性对照）；数据处理（基线扣除，Savitzky–Golay平滑，信噪比（S/N）>3，质量容差±50 ppm）；自动匹配/评分（峰与特异性生物标志物参考库匹配，应用优先级评分）；质量控制（每日：分析炭疽芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌参考菌株，校准仪器；季度能力验证）；结果与基因组决策（若生物标志物特异性符合，报告阳性；若结果模棱两可/失败，启动PCR/基因组确认）。

1. 5.
   结论与未来展望
   各研究报道的生物标志物数量及其显著的变异性，表明实验间及研究团队间缺乏稳健的重现性。这进一步凸显了方法学标准化的迫切需求，尤其是针对真正独有生物标志物的识别、验证及纳入参考数据库，以及实施明确优先考虑特异性的分析算法，以确保MALDI-TOF MS诊断炭疽芽孢杆菌的准确性与可靠性。值得注意的是，文献中提出的多个生物标志物并非炭疽芽孢杆菌独有，部分最初被认为物种特异性的标志物后续在其他芽孢杆菌属物种中也被检出。此外，被列为生物恐怖相关因子的蜡样芽孢杆菌生物变种炭疽（Bcbva）的MALDI-TOF MS表征仍存在较大空白。
   为推动诊断能力提升，未来亟需采用优化方法学与创新分析策略开展研究。前景广阔的方向包括：基于机器学习的光谱模式识别；采用加权评分与分层生物标志物体系的自动化分类系统；整合MALDI-TOF MS与快速分子检测的基因组验证框架；通过LC-MS/MS进行的代谢组学补充；以及高生物安全实验室中样品制备流程的自动化。这些路径共同构成了将当前碎片化的炭疽芽孢杆菌生物标志物研究格局转化为一套连贯、可靠且操作稳健的诊断、监测与生物防御工具的最具希望的发展方向。