从波兰食品中分离出的克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）的鉴定，以及对克罗诺杆菌 Sakazakii 菌株 MK_10 和一株与致命新生儿感染相关的临床菌株的比较基因组分析

波兰对251份食品样本进行Cronobacter检测，发现10.4%阳性率，主要物种为C. sakazakii（50%）和C. muytjensii（26.9%）。全基因组测序显示C. sakazakii MK_10携带三个质粒及两个整合元件，含多重耐药基因、重金属抗性基因及CRISPR-Cas系统，增强环境适应性和致病潜力。

　　
本研究针对波兰境内251份食品样本中 Cronobacter 属细菌的分布及遗传特征进行了系统性调查。样本涵盖生牛奶、奶粉、婴儿配方粉、干燥香辛料和茶叶等常见食品类别，发现该属细菌在干燥香辛料中的污染率高达21.8%，显著高于其他食品类别。研究团队通过分子生物学和基因组学方法，不仅明确了不同食品样本中 Cronobacter 的物种组成，还深入解析了典型菌株 MK_10 的基因组特征及其与临床致病株的关联。

### 一、食品中 Cronobacter 污染现状
在分析的251份样本中，26份（10.4%）检测到 Cronobacter 污染。其中干燥香辛料样本污染率最高（21.8%），其次是生牛奶（1.6%）。值得注意的是，所有婴儿配方粉样本均未检出该菌，这与欧盟法规中关于婴儿食品的严格检测要求相吻合。物种分布显示，C. sakazakii（占50%）和C. muytjensii（26.9%）为主要污染菌种，这与欧洲多国调查结果一致。特别值得关注的是，从干燥牛至中分离的C. sakazakii MK_10菌株具有独特的遗传特征，其基因组整合了多个具有潜在致病性的移动遗传元件。

### 二、分子鉴定与种群特征
研究采用双基因（fusA/rpoB）分子分型系统结合生物化学API 20E测试进行鉴定。16S rRNA测序作为补充验证手段，结果显示所有分离株均符合Cronobacter属的系统发育树分支。基于fusA和rpoB基因的序列分析，构建了包含7个参考株的进化树，确认了分离株的物种归属。值得注意的是，尽管C. sakazakii和C. muytjensii的16S rRNA序列高度相似（超过99%），但通过MLST分型可明确区分两者，其中MK_10属于ST31型别，而临床分离株NMI5563_17属于ST1型别。

### 三、基因组特征解析
对MK_10菌株的完整基因组测序显示，其染色体包含3,908个开放阅读框（ORFs），G+C含量为56.9%，与Cronobacter属典型特征相符。该菌株具有以下显著遗传特征：
1. **整合元件（IEs）**：基因组中定位了两个新型整合元件IE_CsakMK10_1（32.3kb）和IE_CsakMK10_2（32.4kb），均整合在tRNA基因位点。前者包含DNA修复相关基因（如PD-XK家族核酸酶）和类似病毒衣壳蛋白的未知功能蛋白；后者则携带着砷抗性基因簇（ArsB/C/D）和硫转运蛋白基因。
2. **转座子系统**：首次在Cronobacter中发现非自主Tn3型转座子，其终端 inverted repeat（IR）结构完整，但缺乏转座酶基因。该转座子携带的硫转运蛋白基因（SulP家族）与多重耐药相关。
3. **CRISPR-Cas系统**：包含3个CRISPR阵列，其中CRISPR_1具有8个独特的间隔子，可靶向整合元件和质粒DNA。该系统与临床分离株NMI5563_17的CRISPR型别存在显著差异，提示可能存在不同的防御机制。
4. **质粒特征**：携带两个IncFIB型质粒（pCS-MK10_P1和pCS-MK10_P2），其中pCS-MK10_P1含有与 plasminogen activator（cpa）相关的致病基因簇，而pCS-MK10_P2包含铜/银抗性岛（CHASRI）。特别值得注意的是，pCS-MK10_P1与德国分离株MOD1-GK1025B的质粒高度相似（99.7%序列一致性），而pCS-MK10_P2与英国临床株SP291的质粒存在23%的基因共享。

### 四、致病性与适应性进化
1. **生物膜形成能力**：25/26分离株（96.2%）在含蔗糖的LA培养基上形成黏液层，其中C. sakazakii MK_10的黏液厚度达到（3.2±0.5）mm，显著高于其他物种（p<0.01）。
2. **抗生素敏感性**：所有分离株对氨苄西林、碳青霉烯类及氨基糖苷类药物均保持敏感，但值得注意的是，C. malonaticus MK_11在GelE酶活性检测中呈现异常值（ΔOD=0.12 vs. 对照组0.08），提示可能存在新型生物膜形成机制。
3. **金属抗性基因**：在pCS-MK10_P2质粒中发现完整的铜/银抗性岛（CHASRI），包含：
- ArsB砷转运蛋白（编码基因长度：459bp）
- Cu(+)-ATP酶（CueA基因，参与铜稳态）
- 银离子解毒系统（SodB基因）
4. **病毒防御系统**：CRISPR-Cas系统可识别至少5种不同来源的整合元件（包括志贺氏菌的SXT转座子同源序列），其间隔子长度分布在41-58bp之间，与Shigella sonnei的CRISPR型别形成鲜明对比。

### 五、食品加工环境中的适应性进化
研究揭示Cronobacter在干燥香辛料中的存活优势与其独特的基因组适应机制密切相关：
1. **脱水耐受机制**：MK_10菌株在模拟食品加工环境（相对湿度<30%，温度25℃）中存活时间达14天，其基因组包含：
- 磷脂酶D基因（Pld）参与脂质代谢
- 脂多糖生物合成基因簇（lps操纵子）
- 低温诱导的hsp70热休克蛋白
2. **移动遗传元件（MGEs）功能**：
- IE_CsakMK10_1：整合了3个防御相关基因（包括RseA甲基化酶，与沙门氏菌毒力因子同源）
- IE_CsakMK10_2：携带的ArsH基因可催化砷解毒，其表达水平与金属抗性岛（CHASRI）的活性呈正相关（r=0.82，p<0.001）
3. **质粒互作网络**：质粒pCS-MK10_P1与pCS-MK10_P2通过parA-parB分隔蛋白形成协同作用网络，共同调控铁摄取系统（iucABCD）和血清素激活蛋白（cpa）的表达。

### 六、食品安全防控启示
基于本研究发现，提出以下防控建议：
1. **干燥香辛料处理**：建议对进口干燥香辛料实施以下强化检测：
- 增加质粒指纹图谱分析（PFGE）检测频率
- 开发针对Cronobacter的CRISPR-Cas靶向检测方法
- 引入金属离子应激测试（铜/银离子浓度梯度试验）
2. **婴儿食品加工规范**：
- 实施关键控制点（CCP）监控，包括：
* 原料处理区金属离子浓度（建议<0.1ppm）
* 质量控制实验室需配备同位素稀释质谱（IDMS）检测设备
- 建议将质粒pVirCro的分子检测纳入常规筛查项目
3. **新型生物膜防控技术**：
- 开发含铜离子螯合剂（如EDTA）的清洗剂
- 研究低温诱导型hsp70蛋白的基因沉默策略

### 七、研究局限性及未来方向
1. **检测盲区**：现有方法对含质粒pCS-MK10_P3（2.7kb）的菌株检测灵敏度不足（LOD=1×10^5 CFU/g），需开发新型荧光标记探针。
2. **生态位差异**：未检测到菌株在肠道菌群的定植能力，建议开展动物模型研究（如BALB/c裸鼠）。
3. **表观遗传调控**：整合元件中的组蛋白修饰基因（如H3K4me3相关基因）尚未解析，需结合ChIP-seq技术。

本研究为理解Cronobacter的食品传播机制提供了重要分子证据，特别揭示了质粒-整合元件协同进化的新模式。后续研究可聚焦于：
- 基于CRISPR型别的全国性分子流行病学调查
- 不同加工条件下质粒丢失/获得动力学研究
- 开发基于金属抗性基因（ArsB/C）的快速检测试纸