马兜铃酸I通过靶向EZH2/FABP5/RXRA轴激活PPAR信号通路驱动肝细胞癌的机制研究

《Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology》：Deciphering the mechanism of aristolochic acid I-driven hepatocellular carcinoma through integrated network toxicology and bioinformatics

马兜铃酸I(AAI)是明确的肝致癌物，但其在肝细胞癌(HCC)中的分子机制尚不完全清楚。本研究通过整合网络毒理学、生物信息学、分子对接及分子动力学模拟，首次揭示了AAI可能通过靶向EZH2、FABP5和RXRA等核心调控因子，协同激活PPAR信号通路，诱导脂质代谢重编程，从而驱动HCC的发生发展。该研究为阐明AAI的毒理学机制及开发AAI暴露相关肝病的防治策略提供了理论依据。

　　

肝细胞癌(HCC)是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，其发生发展与多种环境暴露、病毒感染及代谢异常密切相关。其中，马兜铃酸I(AAI)作为一种被国际癌症研究机构(IARC)列为I类致癌物的天然化合物，其暴露与HCC的发生及不良预后显著相关。尽管AAI的致癌性已被广泛证实，但其驱动HCC发生发展的具体分子机制，特别是其如何调控肿瘤细胞内的关键信号通路，仍是一个亟待解开的谜团。传统的研究方法往往聚焦于单一通路，难以全面揭示AAI在复杂生物网络中的多靶点协同作用机制。因此，迫切需要一种系统性的研究策略，从整体网络层面深入解析AAI诱导HCC的分子机制。

为了回答这一问题，来自中山大学附属第一医院的研究团队在《Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology》上发表了一项研究，他们创新性地整合了网络毒理学、生物信息学、分子对接及分子动力学模拟等多学科技术，旨在系统性地揭示AAI驱动HCC的分子机制。该研究不仅识别了AAI在HCC中的关键靶点，还深入探讨了其通过调控脂质代谢重编程促进肿瘤进展的潜在通路。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键的技术方法。他们首先利用ProTox-3.0数据库评估了AAI的毒理学特性，并通过PubChem、ChEMBL等数据库预测了AAI的潜在作用靶点。同时，他们从GEO数据库获取了HCC相关的转录组数据(GSE62232)，筛选出差异表达基因。通过整合网络毒理学分析，他们构建了蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，并结合Lasso-Cox回归分析，从TCGA-LIHC队列中筛选出与HCC预后相关的核心基因。为了验证AAI与核心靶点的相互作用，他们进行了分子对接和分子动力学模拟(MD)分析。最后，他们利用TCGA和HPA数据库，对关键基因的表达水平及其与患者预后的关系进行了验证。

分析结果

1. AAI的毒理学特性分析及潜在靶点识别

研究人员首先利用ProTox-3.0数据库对AAI的毒理学特性进行了评估。结果显示，AAI的致癌性概率高达0.77，同时表现出较高的免疫毒性和致突变性概率，这与其已知的I类致癌物身份相符。通过整合ChEMBL、TargetNet和Swiss Target Prediction等多个数据库，研究人员预测了522个AAI的潜在作用靶点。同时，通过对GEO数据库中的GSE62232数据集进行分析，他们筛选出1121个HCC相关的差异表达基因。通过韦恩图分析，研究人员最终确定了52个AAI与HCC的共同靶点，这些靶点可能在AAI诱导HCC的发病机制中发挥关键作用。

2. PPI网络构建及核心靶点筛选

为了识别网络中的关键节点，研究人员利用STRING数据库构建了52个潜在靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，并利用Cytoscape软件进行了拓扑学分析。通过计算网络中每个节点的度值(Degree)，他们筛选出12个关键枢纽基因，包括EZH2、RXRA、CYP3A4、CYP2A6、CYP1A2、CYP4A11、NR1I2、ACSL1、FABP4、FABP5、DNMT1和CYP26A1。这些基因在PPI网络中具有较高的连接度，表明它们在AAI诱导HCC的分子网络中可能扮演着中心调控者的角色。

3. 基于Lasso-Cox回归分析的核心基因筛选

为了进一步筛选出驱动HCC进展的核心基因，研究人员基于TCGA-LIHC队列的临床数据，对52个候选基因进行了Lasso-Cox回归分析。通过设置最优的lambda值(λ=0.0587)，他们成功构建了一个HCC预后预测模型，并识别出ANXA2、EZH2、HMMR和SLC17A5这四个基因作为AAI相关HCC的核心基因。模型验证结果显示，该预测模型的1年生存率ROC曲线下面积(AUC)达到0.76，表明模型具有中等的预测性能。Kaplan-Meier生存曲线进一步证实，高风险组患者的总体生存期(OS)显著短于低风险组。

4. 基于GO、KEGG和GSEA的功能富集分析

为了阐明AAI诱导HCC的潜在生物学机制，研究人员利用Metascape数据库对52个潜在靶点进行了功能富集分析。GO分析结果显示，这些靶点显著富集于脂质代谢相关过程，包括羧酸代谢过程、单羧酸代谢过程、长链脂肪酸代谢过程以及脂质转运的调控。KEGG通路分析则揭示，这些靶点与34条信号通路相关，其中化学致癌作用、代谢通路以及PPAR信号通路是最显著富集的通路之一。值得注意的是，研究人员发现AAI诱导HCC的几个关键靶点蛋白(FABP4、FABP5和RXRA)正是PPAR信号通路中的核心分子。为了验证PPAR信号通路在HCC中的临床相关性，研究人员利用GSE62232数据集进行了GSEA分析。结果证实，PPAR信号通路在HCC组织中的激活状态显著高于正常肝组织，进一步支持了生物信息学的发现。

5. 核心靶点蛋白与AAI的分子对接验证

为了探究AAI与关键靶点蛋白的结合模式，研究人员对通过PPI网络分析和Lasso-Cox回归筛选出的15个关键蛋白进行了分子对接分析。结果显示，AAI与所有蛋白均表现出较强的结合亲和力，能够形成稳定的复合物结构。其中，AAI与EZH2、FABP5和RXRA的结合自由能最低，表明这三个蛋白可能是AAI的主要作用靶点。深入分析结合构象发现，AAI与这三个蛋白均通过多种非共价相互作用形成协同效应，包括氢键、盐桥、π-π堆积以及阳离子-π相互作用等，这些多样化的相互作用模式极大地增强了复合物结构的稳定性。

6. AAI-蛋白复合物的分子动力学模拟

为了进一步验证分子对接结果的可靠性，研究人员选取了结合自由能最低的三个复合物(AAI-EZH2、AAI-FABP5和AAI-RXRA)进行了100纳秒的分子动力学模拟。通过对均方根偏差(RMSD)、均方根涨落(RMSF)和回转半径(Rg)的分析，结果表明三个复合物在模拟过程中均达到了平衡状态，蛋白质保持了紧凑的构象，配体稳定地嵌入结合口袋中，没有发生显著的漂移或解离。蛋白质二级结构含量的时间依赖性图谱显示，主要的二级结构元素在整个模拟过程中保持相对稳定，没有发生显著的结构转变。最后，结合自由能计算结果显示，AAI与EZH2、FABP5和RXRA的总结合自由能分别为-42.53 kcal/mol、-42.17 kcal/mol和-33.64 kcal/mol，进一步证实了AAI与这些靶点之间具有高亲和力和稳定的结合。

7. 基于TCGA和HPA数据库的关键基因差异表达及生存分析

为了验证关键基因的临床意义，研究人员基于TCGA-LIHC数据集进行了分析。结果显示，EZH2、FABP5和RXRA在HCC肿瘤组织中的表达水平显著高于正常肝组织。利用HPA数据库进行的独立验证进一步证实，这些基因在HCC肿瘤组织中的蛋白表达水平也显著上调。生存分析结果显示，EZH2和FABP5的高表达与HCC患者较短的总体生存期(OS)显著相关。虽然RXRA的表达对OS没有显著影响，但EZH2、FABP5和RXRA的高表达均与HCC患者较短的疾病特异性生存期(DSS)显著相关。

研究结论与讨论

本研究通过创新性地整合网络毒理学、分子对接和分子动力学模拟等多学科技术，首次揭示了AAI可能通过靶向EZH2、FABP5和RXRA等核心调控因子，协同激活PPAR信号通路，诱导脂质代谢重编程，从而促进HCC发生发展的分子机制。

首先，研究证实了EZH2、FABP5和RXRA是AAI诱导HCC的关键靶点。AAI不仅与这些蛋白具有高亲和力，还能形成在分子动力学模拟中保持高度稳定的复合物。临床数据分析进一步证实，这些基因在HCC组织中显著高表达，且与患者的不良预后密切相关，凸显了它们在HCC发生发展中的重要作用。

其次，研究揭示了AAI的致癌机制与脂质代谢异常和PPAR信号通路密切相关。功能富集分析表明，AAI的潜在靶点显著富集于脂质代谢相关过程。KEGG和GSEA分析则共同指向了PPAR信号通路的关键作用。值得注意的是，研究筛选出的关键靶点EZH2、FABP5和RXRA，正是PPAR信号通路传导中不可或缺的分子。EZH2作为组蛋白甲基转移酶，通过表观遗传调控影响脂质代谢；FABP5参与脂肪酸的转运，并与PPARγ相互作用；RXRA则能与PPARα形成异源二聚体，其异常表达可促进HCC细胞的脂质代谢异常。这些发现为AAI通过调控PPAR信号通路诱导脂质代谢重编程，进而驱动HCC提供了重要的证据。

该研究为AAI的致癌机制提供了新的视角，即AAI不仅通过DNA损伤(如A:T>T:A突变)促进HCC发展，还可能通过脂质代谢重编程加速肿瘤进展。这一发现具有重要的临床意义。在预防和早期诊断方面，EZH2、FABP5和RXRA可作为AAI相关HCC的潜在生物标志物，用于高危人群的早期筛查。在治疗开发方面，研究提示针对现有药物的靶向干预，如PPAR通路抑制剂(如贝特类药物)或EZH2抑制剂(如GSK126)，可能为治疗这一特定HCC亚型带来希望。

尽管本研究存在依赖公共数据库数据、缺乏独立队列验证等局限性，但它为阐明AAI诱导HCC的毒理学机制奠定了坚实的理论基础，并为开发AAI暴露相关肝病的防治策略提供了新的思路。